Стандартный график строят не менее чем по 5 точкам, рассчитывая его параметры по методу наименьших квадратов (линейная регрессия). Возможно использование встроенной программы обработки данных для построения стандартного графика.
Вычисления проводят до третьей значащей цифры. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений.
Контроль качества определений проводят с периодичностью 1 раз в день с использованием метода добавок. Для этого к проанализированной пробе добавляют стандарт фуллерена в количестве 50-150% от открытого количества и анализируют повторно. Количество дополнительно открытого фуллерена в образце при этом должно составлять от 95 до 105% от расчётного добавленного количества.
IX. Порядок анализа биогенных наноматериалов методами ПЦР, электрофореза и иммуноферментного анализа
Приборы, оборудование и средства измерения, используемые в работе лаборатории, должны быть технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации. Средства измерения регулярно подвергают метрологическому контролю. Используемые приборы должны соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости.
9.1.1 Требования к амплификаторам для проведения реакции ПЦР
Комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых наборов реагентов для выделения ПК, амплификации и детекции результатов исследований. Помещение для каждого этапа проведения ПЦР обеспечивают своим набором лабораторного оборудования.
Для реализации метода применяются амплификаторы со следующими параметрами:
| Температурный диапазон | 35° - 99°С |
| Скорость нагревания | 1.5°С/сек |
| Скорость охлаждения | 1°С/сек |
| Однородность распределения температуры по блоку | 0,2°С |
| Дискретность отображения температуры | 0,1°С |
| Число программ | 20 |
| Макс.число циклов / повторов | 10/99 |
9.1.2.Требования к амплификаторам для проведения реакции ПЦР в реальном времени.
Для постановки ПЦР в реальном времени требуется специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации.
Для реализации метода применяются амплификаторы с компьютерным управлением со следующими параметрами:
| Динамическое термостатирование пробирок с пробами по задаваемой циклограмме в диапазоне,0C | 4 - 99 |
| Разброс температур по лункам, 0C | ± 0.15 |
| Абсолютная погрешность температуры в лунке в диапазоне от 40 до 95 C0 | ± 0.1 |
| Источник света | галогеновая лампа (гарантийный срок службы лампы - 4000 часов) |
| Детектор света | ФЭУ |
| Длина волны возбуждения, нм | 490, 530, 580, 630 |
| Длина волны регистрации, нм | 520, 550, 610, 670 |
| Чувствительность каждого канала по соответствующим флуоресцентным красителям, не более М | 2.5*10-9 |
| Точность и воспроизводимость количества специфической ДНК в пробе в диапазоне | От 1до 109 копий ДНК |
9.1.3. Требования к фотометрическим счетчикам для проведения иммуноферментного анализа
Для реализации метода иммуноферментного анализа используются 96-луночные планшетные фотометры (счетчики), включающие в комплект:
- светофильтры для измерения OD 492 nm, 450nm, 540 nm, 405 nm, 595nm;
- компьютерное или ручное программирование и возможность вывода данных на печать.
Система программирования и вывода данных на печать может осуществляться как ручным вводом, так и компьютерным управлением. Предпочтительнее использовать приборы, отличающиеся возможностью постоянного автоматического использования введенных программ, позволяющие получать данные непосредственно в компьютерном виде, с возможностью последующей цифровой обработки результатов, графических построений и хранения данных.
9.2.1.1. Требования к вспомогательному оборудованию для проведения анализа биогенных наноматериалов методом ПЦР
Перечень вспомогательного оборудования:
1. Центрифуга для пробирок объемом 5-100 см3.
2. Лабораторный встряхиватель (вортекс).
3. Микроцентрифуга от 12 до 16000 g для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 см3.
4. Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 см3 с диапазоном рабочих температур 25-100 град. С.
5. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
6. Одноразовые полипропиленовые микроцентрифужные пробирки с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками объемом 1,5 см3.
7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 и до 1000 мм3.
8. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мм3.
9. Штативы для наконечников, микропробирок объемом 1,5 см3.
10. Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от 2 до 8 град. С, минус 20 град. С.
11. Емкость с дезинфицирующим раствором.
12. Одноразовые полипропиленовые пробирки для амплификации объемом 0,5 (0,2) см3.
13. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 100 мм3.
14. Штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 (0,2) см3..
15. Емкость для сброса отработанных расходных материалов.
16. Источник постоянного тока с напряжением 150-460 В.
17. Трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей.
18. Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов.
19. Компьютер для анализа результатов электрофореза.
20. Микроволновая печь для плавления агарозы.
21. Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы объемом 250 см3.
22. Мерный цилиндр объемом 1 л.
23. Термостат планшетный, поддерживающий температуру 37 град. С.
9.2.1.2. Требования к настольным автоклавам
Автоклав паровой настольный с горизонтальной загрузкой со следующими параметрами:
- Стерилизующий агент - Перенасыщенный водяной пар
- Каркас стерилизатора и внешние панели выполнены из нержавеющей стали
- Материал стерилизационной камеры выполнен из нержавеющей стали
- Материал корпуса двери выполнен из нержавеющей стали
- Объем стерилизационной камеры не менее 20 литров
- Автоматическая блокировка дверей во время выполнения программы
- Визуальный контроль давления в камере, рубашке и парогенераторе
- Блокировка выполнения программы при аварийных ситуациях и сигнализация аварийных ситуаций
- Система управления полуавтоматическая
9.2.1.3. Требования к приборам горизонтального электрофореза
Приборы для горизонтального электрофореза должны быть предназначены для разделения биомолекул в агарозном геле под действием электрического поля, включая разделение продуктов ПЦР, и должны соответствовать следующим характеристикам:
- Электрофоретическая камера должна быть изготовлена из электрохимически нейтрального материала (органического стекла) и снабжена двумя съемными электродами из электрохимически нейтрального сплава
- Электронная схема отключения должна предусматривать автоматическое обесточивание камеры при снятии крышки.
| Предельно допустимое рабочее напряжение, В | 300 |
| Предельно допустимый разогрев прибора при работе,°С | 50 |
9.2.1.4. Требования к ламинарным шкафам
Ламинарный шкаф с вертикальным потоком воздуха должен соответствовать следующим характеристикам:
| Эффективность HEPA- фильтра | 99,997% для частиц > 0,3 мкм |
| Cкорость потока | >0,45 м/с |
| Интенсивность освещения | >1000 Люкс |
| Потребляемая мощность не более | 500 Вт |
| Питание | 220В; 50 Гц |
9.2.1.5. Требования к помещениям для проведения анализа биогенных наноматериалов методом ПЦР
Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими.
Помещение должно быть разделено на три зоны — по числу технологических операций:
| 1. | Зона подготовки реакционной смеси; |
| 2. | Зона пробоподготовки; |
| 3. | Электрофоретическая комната (для проведения качественного анализа биогенных наноматериалов). |
Все три зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными предбоксниками и оснащены устройствами фильтрации воздуха.
Должны быть выделены отдельные помещения для переодевания и хранения верхней одежды, приема пищи, складское помещение для лабораторных материалов.