Перемещение пробирок, штативов и пр. должно производиться только в одном направлении. При этом потоки не должны пересекаться.
Материал, поступивший в лабораторию, должен быть как можно быстрее обработан в комнате пробоподготовки. В эту же комнату должны поступать пробирки с реакционной смесью, приготовленные в комнате подготовки реакционной смеси, для внесения в них подготовленных препаратов ДНК. Готовые пробирки помещают в амплификатор, а после термоциклирования, не открывая крышек, перемещают в комнату для электрофореза.
Все операции (подготовка реакционной смеси, пробоподготовка, электрофорез) должны выполнять разные люди.
Подготовку реакционной смеси следует проводить в ПЦР-боксе, снабженном электрическими розетками, лампами дневного и ультрафиолетового света.
9.2.1.6. Требования к техническому оснащению помещений для проведения анализа биогенных наноматериалов методом ПЦР
Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют бактерицидными лампами в соответствии с "Методическими указаниями по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях" N 11-16/03-06 от 28.02.95. Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории устанавливают из расчета 2,5 Вт/куб. м.
Для обработки материала должны быть установлены ламинарные шкафы, обеспечивающие горизонтальный поток воздуха, а также возможность работы без ламинарного потока и длительную экспозицию облучения внутренних поверхностей ультрафиолетовым светом.
Инактивацию биологического материала проводят в автоклаве в течение 1 часа при 1.5 атм. Допускается использование настольных автоклавов.
Все производственные комнаты должны быть снабжены необходимым оборудованием и расходными материалами, в том числе халатами, закрепленными за соответствующими помещениями.
Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов.
Для проведения исследования используют приборы и расходные материалы (пробирки, наконечники к микродозаторам), исключающие возможность перекрестной контаминации исходного материала, выделенных НК и продуктов ПЦР. Для этого используют:
- термостаты с твердотельным термоблоком;
- пробирки с плотно закрывающимися крышками;
- одноразовые пробирки и наконечники к микродозаторам;
- наконечники, строго соответствующие автоматическим пипеткам, а пробирки для амплификации - термоциклерам (в соответствии с инструкцией фирмы - производителя прибора), смена наконечников после завершения каждой манипуляции является обязательной;
- специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок, устанавливаемые на рабочих местах.
Для каждого этапа проведения ПЦР-исследований необходимо предусмотреть наличие холодильников:
- в комнате приема материала от 4 до 8 град. С, минус 20 град. С (для хранения исследуемых проб);
- в комнате выделения НК от 4 до 8 град. С и минус 20 град. С - для хранения набора выделения НК; от 4 до 8 град. С - для хранения препаратов НК; не допускается хранение препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;
- в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8 град. С и минус 20 град. С - для хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;
- в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8 град. С - для хранения наборов электрофоретической детекции.
Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами". В комнатах, в которых проводят работу с выделенными НК, рабочие поверхности, штативы, оборудование следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. Полы ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих средств, регламентированных санитарными правилами. Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов и штативов 1 N соляной кислотой.
Обеззараживание проб проводят в соответствии с МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР".
9.2.2.1. Требования к вспомогательному оборудованию
При проведении ИФ-анализа, применяется следующее вспомогательное оборудование:
- Автоматические пипетки с переменным объемом для пробоподготовки и 8-канальные автоматические пипетки с переменным объемом для проведения анализа
- Холодильники бытовые, имеющие низкотемпературную камеру (-10-18оС) и камеру +2+8
- автоматические промывочные 96-луночные планшетные устройства при массовых исследованиях свыше 100 образцов
- термостаты- шейкеры с температурным диапазоном +22 оС + 40оС
- дистиллятор или деионизатор воды
- ламинарный бокс с вертикальным воздушным потоком
- аналитические весы
- рН-метр
- настольная центрифуга типа «Эппендорф» с охлаждением (1000-20000 об/мин, +4 оС)
9.2.2.2. Требования к помещениям для проведения анализа биогенных наноматериалов методом иммуноферментного анализа
Помещения, в которых располагается оборудование для исследований, должны отвечать следующим требованиям:
Температура воздуха в помещении 18-25 °C, влажность – (65±15) %, напряженность магнитного поля – не более 0,2 мкТл, шумоизоляция и вентиляция согласно гигиеническим нормам труда.
Электропроводка должна соответствовать мощности приборов и иметь заземляющий контур.
Помещение должно быть оборудовано водопроводом с подачей воды 0,3 м3/час (15±5°C) с системой бактериальной фильтрации и химической дезактивации использованной воды.
Выброс воздуха из ламинарного бокса должен быть выведен наружу и оборудован воздушным фильтром для улавливания наночастиц.
Результаты качественного анализа биогенных наноматериалов методом ПЦР получают путем проведения электрофореза в агарозном геле - пробы, полученной в результате ПЦР (30-40 циклов) и визуальной оценки. Результаты количественного анализа биогенных наноматериалов методом ПЦР в реальном времени получают путем мониторинга накопления продуктов реакции с помощью автоматической (компьютерной) регистрации и интерпретации полученных результатов в соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору для проведения ПЦР - реакции в реальном времени.
Результаты и заключение иммуноферментного анализа по определению наночастиц в биологических образцах должны содержать информацию о количестве специфических наночастиц в исследуемом материале с приведенным расчетом по формуле и в соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору для проведения ИФА, а также -данные печатного протокола измерения калибровочного контрольного стандарта и исследуемого образца.
X. Порядок анализа биогенных наноматериалов на основе корового белка вируса гепатита В
Для первичного и последующего контроля стандартного образца наноматериала на основе корового белка гепатита В используется метод денатурирующего белкового электрофореза в полиакриламидном геле (метод Laemmli 1970). По его данным проверяют соответствие молекулярной массы стандарта и наличие белковых примесей. Полоса, соответствующая рекомбинантному коровому антигену гепатита В, находится в диапазоне между 15 и 20 кДа.
Для подтверждения соответствия и количественного определения наноматериалов на основе корового белка гепатита В используется иммуноферментный анализ, основанный на взаимодействии анализируемого материала с моноклональными антителами против корового антигена вируса гепатита B (HBcAg).
Характеристики планшетного спектрофотометра:
- режимы работы – конечная точка, кинетика;
- возможность подключения к компьютеру;
- режим встряхивания;
- возможность обработки данных и построения стандартных кривых;
- светофильтры 405 и 450 нм.
Типовые эксперименты могут проводиться в соответствии со вторым или третьим уровнями биологической безопасности по классификации ФЗ-86 «О Государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» (1996 г.) или III-IV уровнями патогенности микроорганизмов, в соответствии с санитарными правилами для работы с микроорганизмами I-II либо III-IV групп патогенности и правилами по работе с рекомбинантными молекулами ДНК (1989 г.).
Работа с наноматериалами корового белка должна проводиться в соответствии с требованиями по обеспечению биологической безопасности СП 1.2.2322-08.
Руководство лаборатории несет ответственность за обеспечение надежных мер безопасности по защите персонала лаборатории.
2-й уровень (низкий) - Ф2 (ВL2) - 3-й уровень (средний) -Ф3 (ВL3)
Для экспериментов необходима лаборатория, имеющая специальные инженерные конструкции и защитное оборудование:
- Помещения, в которых располагается оборудование, должны отвечать требованиям, предъявляемым к лабораториям общего и аналитического профиля. Температура воздуха в помещении 18-25 °C, влажность – 65±15 %.
- Помещение должно быть оборудовано водопроводом с подачей воды 0,3 м3/час (15±5°C) с дренажной системой.
- Электропроводка должна соответствовать суммарной мощности электрооборудования.
- Вспомогательное оборудование:
- Система получения высокоочищенной воды (качества MQ);
- Вибромешалка для плашек ИФА;
- Восьмиканальный дозатор для промывки плашек ИФА;