Порядок идентификации наночастиц золота и серебра:
1. обнаружить электронно-плотные частицы или их агрегаты;
2. отметить форму и коэффициент формы наночастиц;
3. отметить характер поверхности наночастиц;
4. отметить присутствие наночастиц в агрегированной форме и сохраняются ли морфометрические признаки наночастиц при образовании агрегатов;
5. получить электронограмму в режиме дифракции сопоставить полученные результаты с референс-образцами.
5.3. Оксидные наночастицы, наночастицы силикатов и алюмосиликатов
Выявление наночастиц оксидов металлов, силикатов и алюмосиликатов так же, как и наночастиц металлов основано на свойстве их высокой электронной плотности. К этой группе следует отнести следующие приоритетные наноматериалы: наночастицы диоксида титана, оксида железа, оксида кобальта, оксида никеля, оксида церия, оксида цинка, оксида меди, оксида алюминия, наноглины. Выявление и идентификацию перечисленных приоритетных наночастиц проводится методами ПЭМ в образцах приготовленных без использования контрастирующих агентов (солей тяжелых металлов).
Отличительной особенностью наночастиц оксидов металлов является неоднородность распределения электронной плотности частиц. Признак связан с разнообразием форм наночастиц оксидов, присутствием крупных выступов, неровностей, шероховатостей на поверхности наночастиц. Оксиды металлов обладают высокой степенью полиморфизма. Коэффициент формы наночастиц варьирует в широком диапазоне. Агрегированное состояние характерно для наночастиц оксидов. Агрегаты различной формы и размеров сохраняют признаки отдельных наночастиц. При анализе на присутствие наночастиц оксидов в низких концентрациях в водной среде следует учитывать возможное уменьшение электронной плотности по сравнению с референс-образцами, что связано с растворимостью конкретных оксидов. Для идентификации наночастиц обязательным является получение электронограммы в режиме дифракции или спектров характеристических потерь энергии электронов (СХПЭЭ).
Порядок идентификации:
1. обнаружить электронно-плотные наночастицы или их агрегаты;
2. отметить форму и степень варьирования коэффициента формы;
3. отметить степень неровности и шероховатости поверхности;
4. отметить присутствие наночастиц в агрегированной форме и сохраняются ли морфометрические признаки наночастиц при образовании агрегатов;
5. получить электронограмму в режиме дифракции или спектров характеристических потерь энергии электронов (СХПЭЭ);
6. сопоставить полученные результаты с референс-образцами.
Для получения достоверных результатов необходим анализ как минимум 10 случайных полей изображения.
5.4. Квантовые точки
Идентификация квантовых точек осуществляется на основе выявления у них специфической флуоресценции. Длины волн возбуждения и эмиссии флуоресценции представляются заказчиком или могут быть определены на спектрофлуориметре в автоматическом режиме. Исследованию подвергается разбавленная водная дисперсия наноматериала или содержащей его пробы. Идентификация квантовых точек проводится путём сравнения максимума спектра флуоресценции с паспортным значением или величиной для стандарта, а количественное определение – путём сравнения интенсивности флуоресценции анализируемого и стандартного образца. При количественном спектрофлуориметрическом определении необходимо учитывать наличие артефактов, обусловленных мутностью дисперсных сред и возможным наличием в составе комплексной продукции веществ – гасителей флуоресценции.
5.5. Наночастицы органических полимеров
Выявление и идентификация наночастиц органических полимеров (латексов, дендримеров) в составе продукции проводится с использованием метода ПЭМ с контрастированием солями тяжёлых металлов. Критериями идентификации наночастиц является размер частиц и распределение частиц по размеру. В случае полимерных частиц, несущих флуоресцентную метку, их выявление и идентификация может проводиться с использованием метода спектрофлуориметрии, аналогично квантовым точкам.
Выявление и идентификация наночастиц органических полимеров (латексов, дендримеров) в составе продукции проводится с использованием методов ПЭМ. При низком электронном контрасте анализируемых наночастиц рекомендуется подбирать оптимальные способы контрастирования этих наночастиц в составе проб солями тяжёлых металлов.
5.6. Биогенные наночастицы
При выявлении и идентификации наночастиц биогенного происхождения в составе продукции заявитель предоставляет сведения о составе наночастиц (ДНК-, РНК-содержащие наночастицы, белковые наночастицы, наночастицы других типов биополимеров) и об их видовой принадлежности. В соответствии с этим выбирается метод идентификации, отвечающий наибольшей биологической специфичности тестирования, из следующего списка:
1) ДНК содержащие наночастицы – полимеразная цепная реакция (ПЦР) с видоспецифическим олигодезоксирибонуклеотидным праймером в варианте ПЦР с электрофоретическим разделением (идентификация) или ПЦР в реальном времени (количественное определение).
2) РНК-содержащие вирусы – ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) с двумя нетождественными видоспецифичными олигодезоксирибонуклеотидными праймерами.
3) Белок-содержащие наночастицы – двухвалентный твёрдофазный иммуноферментный тест (ИФА) или ЭФ в ПААГ с электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную мембрану и иммуноблоттингом. Используются моноклональные видоспецифические антитела против определяемого белка и антивидовые антитела, конъюгированные с пероксидазой.
4) Прочие биогенные наночастицы. Метод определяется спецификой анализируемого наноматериала. Для большого числа биогенных наночастиц может быть применён метод биотестирования специфической биологической активности. Сведения о подходящей для биотестирования модели предоставляются заявителем.
VI. ПОРЯДОК ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ НАНОЧАСТИЦ И НАНОМАТЕРИАЛОВ
6.1.1. Для реализации метода применяются просвечивающие электронные микроскопы, оборудованные системой цифровой регистрации изображений и имеющие в своем составе модули для измерения дифракции электронов и спектров характеристических потерь энергии электронами, со следующими параметрами:
- величина ускоряющего напряжения электронов не менее 80 кВ
- максимальное увеличение не менее 100000
- диапазон увеличений в режиме СХПЭЭ не уже чем от 20 до 300
- система фильтрации электронов по энергии и параллельная детектирующая система спектров потерь энергии с разрешением по энергии не хуже 2 эВ и областью изменения энергии в диапазоне от 0 до 1000 эВ или больше
- наличие режима дифракции параллельного пучка электронов. В этом режиме апертурная диафрагма должна избирательно ограничивать освещаемую область образца в диапазоне размеров (по диаметру) от 1 до 50 мкм или в более широком диапазоне.
- предельное разрешение двух точек (по техническому паспорту) не хуже 0,4 нм;
- предельное разрешение двух линий (по техническому паспорту) не хуже 0,25 нм.
Примеры аппаратуры, удовлетворяющей указанным требованиям, приведены в справочном приложении.
6.1.2. Подготовка электронного микроскопа к работе.
Ежедневно после включения микроскопа проверяются и корректируются (при необходимости) следующие настройки:
- настройка катода и наклон источника освещения.
Оптимальный режим накала устанавливается по изображению катода на люминесцентном экране ПЭМ, а именно, по изображению кроссовера. Нарушение ориентировки пушки устраняется путём изменения её угла наклона (в соответствии с инструкцией к конкретному прибору).
- настройка конденсорной диафрагмы.
При сведении (фокусировке) и разведении (дефокусировке) луча на люминесцентном экране освещённая область должна симметрично приближаться к центру (при фокусировке) или к краям экрана (при дефокусировке).
- коррекция астигматизма конденсорной линзы (астигматизма пятна).
При сведении луча освещённое пятно на экране должно иметь форму круга, а не эллипса.
- настройка объективной диафрагмы
Объективная диафрагма должна быть отцентрирована. Следует отметить, что срок службы объективных диафрагм в среднем составляет около 3-х лет, после чего их следует заменять. Старые загрязнённые диафрагмы могу стать причиной ухудшения качества изображения
- коррекция астигматизма проекционной линзы.
Проверяется и настраивается в режиме дифракции по форме каустики. Кроме того, одним из признаков появления астигматизма является смещение изображения в стороны при настройке фокуса (при скорректированном астигматизме оно может лишь вращаться вокруг центральной оси).
Раз в неделю, а также при возникновении подозрения на нарушение коррекции астигматизма проверяется и корректируется
- коррекция астигматизма объективной линзы
Проверка и коррекция проводится с помощью тест-образца, имеющего неоднородности с чёткими краями (рекомендуется использовать углеродную пленку с дырочками), по симметричности (должны быть симметричны) полос Френеля, формирующихся на краях неоднородностей (на краях дырочек в углеродной пленке), при фокусировке и дефокусировке изображения (выполняется путем дефокусировки линз объектива). Возникновение такого астигматизма может быть связано с загрязнением электронной оптики. До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для коррекции астигматизма, рекомендуется использовать образец «astigmatism сorrection holey carbon film» (каталожный номер 609, фирмы «Ted Pella. Inc.», США), который соответствует стандарту ISO9001/9002.