Детальные инструкции по проверке и коррекции перечисленных выше настроек приведены в инструкциях к конкретным электронным микроскопам. Неправильные настройки и нескорректированный астигматизм линз приводят к ухудшению качества изображения.
6.1.3. Плановая проверка качества настройки электронного микроскопа.
Не реже 1 раза в месяц проверяется правильность настройки микроскопа, включая следующие параметры: разрешающая способность микроскопа, калибровка масштаба изображения на ПЗС камере при различных коэффициентах увеличения (в первую очередь в рабочем диапазоне увеличений). Выбираются ускоряющее напряжение и параметры линз объектива, при которых будут проводиться измерения дифракции электронов, при этих параметрах измеряется дифракция электронов от стандартного образца и, при необходимости, определяется специальный коэффициент, обеспечивающий пересчет диаметров окружностей на дифракционной картине в межплоскостные расстояния кристаллической решетки для анализируемых образцов. Для проверки перечисленных параметров используются соответствующие стандартные образцы. Поверка осуществляется в соответствии с документацией производителя электронного микроскопа и действующими СОП.
Разрешающая способность проверяется путем получения изображений от кристаллов, в которых должны быть видны (разрешены) плоскости кристаллической решетки. В зависимости от предельной разрешающей способности микроскопа в качестве стандартных рекомендуется использовать следующие образцы: кристаллы асбеста-крокидолита (межплоскостные расстояния 0,903 и 0,452 нм; опасен для здоровья – использовать с осторожностью!), кристаллы фталоцианина меди (межплоскостные расстояния 1,03 нм), графитизированный углерод (межплоскостные расстояния 0,34 нм), ориентированные кристаллы золота (межплоскостные расстояния 0,204, 0,143 и 0,102 нм). До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для поверки разрешающей способности электронных микроскопов, рекомендуется применять следующие образцы фирмы «Ted Pella. Inc.», США, соответствующие стандарту ISO9001/9002: аsbestos-сrocidolite (каталожный номер 624), copper phthalocyanin (каталожный номер 629-1), graphitized carbon black (каталожный номер 645), orientated gold crystals (каталожный номер 646).
Для калибровки линейных размеров при измерениях с помощью электронных микроскопов используется электронно-прозрачный стандартный образец с регулярными неоднородностями, расстояние между которыми известно (например, реплики дифракционных решеток с известным расстоянием между штрихами). Калибровку производят, получая изображения реплики дифракционной решетки при различных значениях увеличения микроскопа (Г), используемых в анализе наночастиц и фиксированной дискретности оцифровки изображений (фиксированный размер цифрового изображения X´Y в пикселах). По полученным цифровым изображениям выбирают два крайних штриха (крайний левый и крайний правый или крайний верхний и крайний нижний в зависимости от ориентации решетки), подсчитывают число промежутков между этими штрихами на изображении (n) и число пикселов цифрового изображения, соответствующих расстоянию между крайними штрихами (p). Масштаб (M) цифрового изображения при неизменных параметрах Г и X´Y рассчитывают в единицах нм/пиксел по формуле:
М (Г, X´Y)= n´l/p,
где l – это известное (стандартное) расстояние между штрихами решетки в нм.
Масштабирование выполняют для фиксированного набора увеличений микроскопа Г и фиксированного размера цифрового изображения X´Y. В дальнейшем при анализе наночастиц регистрацию изображений выполняют только при тех значениях Г и X´Y, при которых проведена калибровка масштаба М.
Для проведения калибровки увеличения микроскопа и масштабирования цифровых изображений могут быть использованы специальные программные опции, предусмотренные в программном обеспечении к электронному микроскопу. Эти опции облегчают проведение калибровки и обеспечивают автоматическое введение масштаба или масштабных меток в цифровые изображения.
До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для калибровки линейных размеров при измерениях с помощью электронных микроскопов, рекомендуется применять следующий образец фирмы «Ted Pella. Inc.», США, соответствующий стандарту ISO9001/9002: magnification calibration diffraction grating replica (каталожный номер 606).
Для более точного определения размеров наночастиц рекомендуется:
− анализ исследуемых образцов выполнять при том же значении тока объективной линзы, при котором выполнялась калибровка увеличения и масштаба с применением стандартного образца;
− обеспечить одинаковое положение образцов (стандартного и анализируемых) в держателе образцов, а также одинаковое положение держателя в приборе;
− обеспечить одинаковую ориентацию образцов (стандартного и анализируемых) в держателе, то есть всегда либо подложкой вверх, либо подложкой вниз.
− не использовать искривлённые сеточки и бленды.
При выборе и контроле параметров для проведения измерений дифракции электронов применяется стандартный поликристаллический образец, для которого известны межплоскостные расстояния кристаллической решетки. С использованием этого образца контролируется стабильность параметров, влияющих на точность и воспроизводимость дифракционного анализа, таких как токи линз, значение напряжения и расстояние от образца в держателе до матрицы ПЗС. На основе дифракционной картины, измеренной от стандартного образца, определяют и корректируют специальный коэффициент, с помощью которого возможен пересчет диаметров окружностей на дифракционной картине в межплоскостные расстояния кристаллической решетки для анализируемых образцов.
До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для контроля параметров микроскопа при дифракции электронов, рекомендуется применять следующий образец фирмы «Ted Pella. Inc.», США, соответствующий стандарту ISO9001/9002: diffraction standard evaporated aluminum (каталожный номер 619).
Проверка и калибровка энергетического фильтра, используемого в режиме СХПЭЭ, должна выполняться сертифицированным специалистом по обслуживанию электронных микроскопов данной марки.
6.1.4. Внеплановые проверки качества настройки электронного микроскопа
Внеплановая проверка качества настройки электронного микроскопа проводится, если в процессе измерений выявляются артефакты, которые, по мнению оператора, могут быть связаны с разъюстировкой микроскопа. Если очередная или внеочередная проверка выявила существенную разъюстировку микроскопа по одному или нескольким из перечисленных выше параметров, то определение наночастиц в образцах проводиться не может до устранения неисправности.
6.1.5. Основные требования к электронному микроскопу, применяемому для визуализации и идентификации наночастиц.
Электронный микроскоп может применяться для определения наночастиц в образцах и пробах, если при проверке правильности настройки микроскопа, получены следующие результаты:
- тест на разрешающую способность подтверждает, что разрешение микроскопа не хуже 0,5 нм;
- удалось добиться эффективной коррекции астигматизма;
- масштаб изображений откалиброван с точностью до 5%.
- измерена длина камеры (расстояние между образцом и ПЗС-матрицей) и определены ускоряющее напряжение и параметры линз объектива, при которых будут проводиться измерения дифракции электронов в исследуемых образцах.
6.2.1. Помещения, в которых располагается оборудование для электронно-микроскопических исследований, должны отвечать следующим требованиям.
Микроскоп должен быть установлен в помещении такой площади, чтобы расстояние от боковых и задней частей микроскопа до стен было не менее 1 м с высотой потолка 2,5 м. Температура воздуха в помещении 18-25 °C, а максимальный дрейф температуры не превышает 3ºС/час, если иное не указано в техническом паспорте к конкретному электронному микроскопу. Влажность в помещении – (65±15) %, напряженность магнитного поля – не более 0,2 мкТл, вибрация пола – не более 0,2 мм/сек для 5-50 Гц, если иное не указано в техническом паспорте к конкретному электронному микроскопу.
6.2.2. Электропроводка должна соответствовать мощности электронного микроскопа. Сопротивление заземляющего контура - не более 4 Ом.
6.2.3. Помещение должно быть оборудовано водопроводом с подачей воды 0,3 м3/час (15±5°C) с дренажной системой. Выброс воздуха из вакуумного насоса должен быть выведен наружу и оборудован воздушным фильтром для улавливания проскочивших наночастиц.
6.2.4. Должны быть соблюдены дополнительные требования к помещению, такие как, например, требования к кондиционированию воздуха, подаче азота и т.п., если эти требования указаны в техническом паспорте к конкретному электронному микроскопу.
6.2.5. При подготовке образцов к электронно-микроскопическому исследованию, применяется вспомогательное оборудование, характеризуемое следующими параметрами:
− Ультрамикротом, обеспечивающий получение ультратонких срезов биологических и физических образцов толщиной 30-100 нм, скорость резания 0,4 - 1 мм/с, термоподача 40 – 60 нм.
− Прибор для изготовления стеклянных ножей для ультрамикротомов.
− Стеклянные или алмазные ножи.
− pH-метр, ± 0,1 pH.
− Весы, ± 0,1 мг.
− Центрифуга – 6000 об/мин, центрифугируемые объёмы от 1 см3 до 100 см3.
− Термостаты: от 37ºС до 110ºС, ± 0,1ºС.
− Дистиллятор.
− Аппарат для перемешивания растворов (магнитная мешалка, механическая мешалка).
− Электромешалка (для приготовления эпоксидных смол).
− Ламинарный бокс биологической безопасности класс III или вытяжной шкаф, оборудованный фильтром для улавливания наночастиц.
− Холодильник – для проведения обработки образцов и хранения реактивов при +4ºС, холодильник для хранения реактивов при -18 ºС .