6. АУТОАНТИТЕЛА КАК СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ СИСТЕМНЫХ КОЛЛАГЕНОЗОВ.
Впервые проявления специфического LE- феномена было зарегистрировано в 1948 г в процессе инкубации сывороток различных пациентов со взвесью лейкоцитов нормальных доноров. Годом позже был идентифицирован сывороточный иммуноглобулин, осуществляющий антинуклеарную реакцию, лежащую в основе LE-феномена. Определение LE- клеток доминировало в 50- 70 годы как основная реакция выявления антинуклеарных антител (ANA).
В 80-х годах для выявления ANA был предложен метод непрямой иммунофлуоресценции, с тестированием сыворотки пациентов на срезах тканей почек и печени кролика (мыши), либо на культуре раковых эпителиоидных клеток человека (Hep-2). Метод зарекомендовал себя как высокочувствительный и специфичный, позволяющий регистрировать одновременное присутствие аутоантител к почти 40 отдельным ядерным антигенам. Особенности характера распределения специфического свечения при учете реакции (гомогенное, крапчатое, периферическое, связанное с ядрышками или с центромерами, наличие цитоплазматических связывающих фокусов) позволяет в первом исследовании определить основную антигенную специфичность выявляемых аутоантител. К недостаткам данного метода следует отнести относительную трудоемкость, зависимость от оптических характеристик люминисцентного микроскопа, а также проблемы стандартизации и контроля качества, в основном связанные с использованием тканей животных или клеточных культур.
Одновременное развитие получил метод использования твердофазного ИФА как для выявления суммарного комплекса антинуклеарных аутоантител (ANA- скрининг), так и для выявления отдельных аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам (ENA-скрининг и ENA-профиль). Достоинствами метода являются возможность автоматизации и высокая производительность. Чувствительность и специфичность сравнима с РНИФ, правда использование в некоторых тест-системах рекомбинантных антигенов потенциально может вызывать ложно положительные результаты при тестировании сывороток с высоким титром антибактериальных антител.
Другие известные методы идентификации аутоантител к ENA - иммунодиффузия в геле, иммуноэлектрофорез, гемагглютинация, иммунопреципитация и иммуноблотинг широкого применения в практике клинической лаборатории пока не получили.
Перечень наиболее важных аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам представлены в таблице 5 :
Таблица 5. Основные серологические маркеры аутоиммунных заболеваний
| Антиген | Оригинальное название | Молекулярная структура | Функция | Диагностическое значение |
| Sm | Smith (имя пациента) | Комплекс, сформированный из 9 протеинов с 13 малыми молекулами РНК | Расщепление предшественников матричной РНК | *Cпецифичность к СКВ *Sm + и RNP + = высокий риск люпус- нефрита *Может выявляться при отсутствии dsDNA. |
| Sm/RNP комплекс | RNP - частицы рибонуклео-протеина | Нативный комплекс Sm и RNP антигенов | Расщепление предшественников матричной РНК | СКВ, синдром Шегрена, склеродермия, полимиозит, СБСТк |
| U1RNP | основной антиген (68 rDa) комплекса U1RNP | Всегда находится в паре с RNA U1. | Расщепление предшественников матричной РНК | * RNP + , Sm - = низкий риск нефрита * высокие титры на фоне "отр" других ANA = СБСТк |
| SSA или Ro | Растворимая (soluble) субстанция (substance) А или протеин А синдрома Шегрена или Robert-антиген (имя пациента) | протеины 52 и 60 кД связанные с молекулами цитоплазматической РНК | Неизвестно | *синдром Шегрена и СКВ *блокада сердца новорожденных в результате трансплацентарного перехода антител *SSA + , SSB+ = низкий риск нефрита *SSA+, SSB - = высокий риск нефрита |
| SSB или La | Растворимая (soluble) субстанция (substance) В или протеин В синдрома Шегрена или Lane-антиген (имя пациента) | Фосфопротеины, связанные с транскриптами полимеразы III | Терминатор транскрипции хеликазы | *синдром Шегрена, СКВ *SSA + , SSB+ = низкий риск нефрита |
| dsDNA | Двух-цепочная ДНК | Нативная двух-цепочная ДНК свободная от протеинов | Носитель генетической информации | *СКВ, мониторинг течения * Вовлеченность ЦНС и почек |
| Histones | Гистоны | Базисные протеины, связанные с ДНК | Структурные элементы хроматина | Лекарственная СКВ |
| CENP-B | Протеин (protein) центромеры | Протеин кинетохора 80 кД | Место прикрепления микрофиламентов | Склеродермия, КРЕСТ-синдром |
| Jo l | Специфический протеин 1 больного с миозитом | Протеин 55кД, гистидин-тРНК синтетаза | Соединение тРНК с гистидином | * Полимиозит более характерен, чем дерматомиозит * Ассоциирован с интерстициальной пневмонией |
| PM-Scl-100 | 100 кД антиген полимиозита-склеродермы (polyniyositis -scleroderma) | Часть мультипротеинового комплекса с содержанием не менее 11 протеинов | Синтез рибосомального предшественника | Полимиозит-склеродермо-КРЕСТ- синдром |
| Scl-70 | 70 rL антиген склеродермы (scleroderma) | 70 кД продукт деградации протеина с массой 100 кД | Топоизомераза I Денатурация ДНК (раскручивание) | *Склеродерма и реже КРЕСТ -синдром |
В дифференциальной диагностике основных коллагенозов важное значение придается анализу маркеров аутоиммунных заболеваний выявленных как методом иммунофлуоресценции, так и в ИФА (табл. 6).
|
Тип патологии | Результаты иммунологического исследования | Клиническая ценность |
| Тип антител и частота их встречаемости (%) | ||
| Системная красная волчанка | * ANA 95-99% * dsDNA 50-75% *Sm 30% * RNP 25-40% *SSA(Rо) 30-40% * SSB(La) 10-15% * антифосфолипидные антитела 30-50% * PCNA 2-10% *анти-Кu (Кi) 10% | ANA и ENA - скрининг (выявление); анти-nDNA и анти-Sm — маркеры мониторинга |
| Дискоидная красная волчанка | Картина нормы (как правило, нормальные титры ANA) | LE-полосы в биоптатах кожи (в РПИФ) высокоспецифичны |
| Подострая кожная красная волчанка | * ANA 70% • SSA (Ro) > 60% | анти-SS-А(Rо) высокоспецифичны |
| Красная волчанка новорожденных | *ANA 70% • SS-А(Ro) 60% * SS-B(La) 60% | Анти-SS-А(Rо) высокоспецифичны |
| "Лекарственная" красная волчанка | *ANA > 90% * антитела против гистонов > 90% Остальные ANA и анти-ENA отсутствуют | антигистоновые антитела высокоспецифичны при отсутствии других ядерных антител |
| Смешанное заболевание соединительной ткани | • ANA (крапчатый тип окрашивания) > 95% • анти-RNP > 90% | Ценную диагностическую информацию дает характер окрашивания ядер в биоптатах кожи и при исследовании сыворотки крови методом непрямой иммунофлуоресценции |
| Синдром Шегрена | • ANA 55% . *SS-A(Ro) 43-88% .*SS-B(La) 14-60% Присутствие ревматоидного фактора(RF) | Диагноз подтверждается положительными данными серологических исследований |
| Склеродермия | • ANA 85% (Крапчатый или ядрышковый тип окрашивания) CREST: *антицентромерные антитела 70-90% Диффузный склероз: • анти-Sсl -70 45% Акросклероз: • анти-Scl-70 15-20% | *Антицентромерные антитела -маркер КРЕСТ- синдрома *Scl-70 — маркер склеродермии Диагностическая ценность прямой иммунофлуоресценции биоптатов кожи невелика |
| Полимиозит дерматомиозит | Общий признак: • ANA 80% Дерматомиозит: • анти-Jo-l 10% Полимиозит: • анти-Jo-l 30% • SS-А(Rо) 55% • анти-Кu(Кi) 10% (также наблюдаются при склеродермии) | Положительные результаты серологического исследования могут использоваться для подтверждения диагноза |
| Ревматоидный артрит | • ANA низкие титры или отсутствие • RF 90% • RANA 70-90% (присутствует в 95% сывороток не содержащих RF) | Результаты серологического исследования используются для подтверждения диагноза |
Определение ANA в реакции непрямой иммунофлуоресценции
При осуществлении типичного теста, сыворотку пациента инкубируют с антигенными субстратами (ткань печени или почек животных, культура клеток Hep-2) для осуществления специфического связывания имеющихся в сыворотке антител с клеточными ядрами клеток. После отмывания несвязавщихся белков сыворотки, субстрат инкубируют с антителами против человеческих иммуноглобулинов. Поскольку вносимые антитела коньюгированы с флуоресцирующим веществом, при наличии в сыворотке антител к ядерным антигенам образовавшийся комплекс (ядерный антиген + антиядерные антитела сыворотки + антитела к антителам человека + флюоресцирующее вещество) можно выявить при люминесцентной микроскопии. Характер свечения - периферический, диффузный, крапчатый и т.д. позволяет выявить связь с конкретными внутриядерными структурами см. Таблицу 7:
Таблица 7. Оценка результатов определения ANA в реакции непрямой иммунофлуоресценции.
| Характер свечения | Антигенная специфичность | Клиническое значение |
| Периферическое или краевое | dsDNA, lamins. nuclear pore complexes | Первичная СКВ |
| Гомогенное (диффузное) | dsDNA | Специфичность 20 - 40 % при активной СКВ, вовлеченность ЦНС и почек |
| Гистоны | Идиопатическая СКВ- 50 -70 % , лекарственная СКВ - 95%, локальная склеродерма | |
| Крапчатость: грубая | U1-RNP | СКВ 20%-40%: C<CNr > 95% |
| SM | Маркер СКВ 15%-30% | |
| Тонкая (пылевидная) | SS-A(Ro) | СКВ 24%-60%; волчанка новорожденных > 90%: Дефицит комплемента (C2 and C4)/LE > 90%; Синдром Шагрена 85%-95% |
| SS-B (La) | СКВ 9%-35%; волчанка новорожденных 75%; Синдром Шегрена 70%-85% | |
| DNA-polymerase | СКВ 3% | |
| Mi-2 | Дерматомиозит (DM) 15%-35%: Полимиозит (PM) 5%-9% | |
| дискретная | Белок центромер - включения схожие по размеру и количеству | Ограниченная склеродермия 60%-80%: dilluse scleroderma - 8%; Синдром Рейно 25%; ПСС -КРЕСТ 50%-70% |
| NSP-1(pseudo АСА) -включения различного размера и количества | Ревматические заболевания и хронические болезни печени | |
| Внутриядерное свечение Типа "Clumpy" | Фибрилларин (U3 RNP) | ПСС 6%-8%; dilluse scleroderma - 5%: КРЕСТ - 10% |
| Крапчатое | RNA-polymerase 1 | ПСС 4%-20%; dilluse scleroderma -13% |
| Гомогенность: (нуклеолы/нуклеоплазма) | ||
| Слабая крапчатость нулеол) / вид "матового стекла" нуклеоплазмы | DNA-topoisomerase 1 (Scl-70) | ПСС 4%-20%; dilluse scleroderma -13%: |
| Сильное гомогенное свечение нуклеол / слабое гомогенное свечение нуклеоплазмы | PM-ScI | PM/ПСС - 24% |
| Сильное гомогенное свечение нуклеол и нуклеоплазмы | Ku | Scleroderma 1%-14%; PM/ScI 26%-55%; SLE 1%-19%; Sjogren's syndrome - 20% |
| Крапчатое свечение цитоплазмы | Jo-1 (histidyl tRNA synthetase) PL-7 (threonyl tRNA synthetase) PL12 (alanyl tRNA synthetase) | PM 18%-36%; DM - 13%; PM/DM - 43% PM/DM 3%-5% PM/DM - 3% |