Практикум предназначен для студентов 2, 3, 4 курсов технологических специальностей, всех форм обучения. Авторы: Панов Валерий Петрович (стр. 4 из 16)

Электрофоретическая подвижность белка (m) пропорциональна заряду молекулы, Z, деленному на коэффициент трения, f, т. е. m = Z/f, причем коэффициент трения связан с молекулярной массой и формой биополимера.

Для определения изоэлектрической точки (рI) белка используют метод изоэлектрического фокусирования. Градиент рН устанавливают с помощью смеси низкомолекулярных органических кислот и оснований.

Изоэлектрические точки некоторых белков

Белок	рI
Пепсин	1,0
Яичный альбумин	4,6
Сывороточный альбумин	4,9
Уреаза	5,0
b-Лактоглобулин	5,2
Гемоглобин	6,8
Миоглобин	7,0
Химотрипсиноген	9,5
Цитохром С	10,7
Лизоцин	11,0

Взаимодействие антитело-антиген используют для качественного определения белков, установления места их локализации. Антитела есть Y-образные белки (иммуноглобулины), состоящие из 4 полипептидных цепей. .При этом в процедуре определения могут быть использованы как поликлональные, так и моноклональные антитела, последние синтезируются популяцией идентичных антител (клон). Моноклональные тела столь специфичны, что могут различить два белка, отличающихся только одной аминокислотой.

Функция белка зависит от его аминокислотной последовательности, называемой первичной структурой белка. Человек производит до 40000 различных белков, каждый тип белка имеет уникальную структуру. В человеческой популяции аминокислотная последовательность белков не строго фиксирована, имеются некоторые вариации в составе, которые практически не оказывают влияние на функции белка.

Существует ряд приемов определения аминокислотной последовательности белка, наиболее распространен метод Эдмана - пошаговой деградации белка (секвинация). Большие белки предварительно разделяют на малые фрагменты (разрушение дисульфидных связей, направленная фрагментация полипептидной цепи).

Аминокислотная последовательность может быть выведена, если известна последовательность ДНК.

Вопросы для самоконтроля

1. Молекулярные массы белков крови.

2. Размеры молекул белков.

3. Чем определяется суммарный электрический заряд молекул белков?

4. Изоэлектрические точки наиболее распространенных белков.

5. Методы очистки белков.

6. Определение аминокислотной последовательности белков.

Тестовые вопросы

1. Какая связь формирует вторичную структуру белков.

а) водородная связь;

б) ковалентная связь;

в) сложноэфирная;

г) пептидная связь.

2. Какие факторы приводят к денатурации белков?

а) tºС;

б) гидролиз;

в) добавление NaCl.

3. Что такое простетическая группа белка?

а) небелковая часть;

б) белковая часть;

в) SH – группы;

г) минеральные вещества.

4. К каким белкам относятся альбумины?

а) к протеидам;

б) к протеинам;

в) к простетической группе.

5. Что такое нативная конформация белка?

а) природное состояние белка;

б) выпавший в осадок белок;

в) закристализованный.

ТЕМА 3. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ

Ковалентный скелет белков состоит из сотен индивидуальных связей. Если было бы возможно свободное вращение вокруг даже части этих связей, белки имели бы почти безграничное число трехмерных структур. Однако каждый белок имеет специфическую функцию, что предполагает для него уникальную пространственную структуру. Тот факт, что белки кристаллизуются, дает убедительное доказательство наличия таких структур. Строгий молекулярный порядок в кристалле может быть реализован в том случае, если все молекулы имеют идентичную форму в кристалле. Фермент уреаза с ММ 483кДа был среди первых закристаллизованных белков.

Пространственное расположение атомов в молекуле белка называют его конформацией. Изменения конформации встречаются при вращении вокруг одинарных связей без их разрушения. В белках реализуются четыре уровня архитектуры.

Первичная структура связана с ковалентными связями между аминокислотными остатками (аминокислотная последовательность). Относительное пространственное расположение связанных аминокислот не является специфичным. Полипептидные цепи не могут иметь любые пространственные структуры по выбору. Стерические ограничения, а также множество слабых невалентных взаимодействий приводят к тому, что отдельные пространственные формы более устойчивы чем остальные.

Вторичная структура относится к регулярным расположениям соседних аминокислотных остатков в полипептидной цепи (регулярные конформации). Для вторичной структуры полипептидных цепей наиболее характерны a-спираль и b-конформация.

Третичная структура относится к пространственному расположению всех аминокислот полипептида. Связь между вторичной и третичной структурой в настоящее время не достаточно ясна. Несколько различных типов вторичной структуры часто обнаруживаются в третичной структуре большого белка.

Белки с несколькими пептидными цепями имеют еще один более высокий уровень организации: четвертичную структуру, которая относится к пространственному расположению полипептидных цепей или субъединиц в белке. Можно выделить промежуточные уровни между вторичной и третичной структурой. Устойчивый кластер из нескольких элементов вторичной структуры относят к супервторичной структуре. Еще более высокий уровень структуры представляет домен. Его относят к компактной структуре, включающей возможно от 40 до 400 аминокислот, домен представляет отчетливую единицу в большой полипептидной цепи. Многие домены складываются независимо в термодинамически устойчивые структуры. Большая полипептидная цепь может содержать несколько доменов, которые легко различимы. В некоторых случаях индивидуальные домены имеют отдельные функции.

Конформация белка стабилизируется большим числом слабых невалентных взаимодействий. Устойчивость нативной конформации белка невелика, так разность в свободной энергии сложенных и несложенных состояний в типичных белках в физиологических условиях находится в интервале от 20 до 65 кДж/моль. Энтропия и водородное связывание многих групп полипептидной цепи с растворителем (водой) приводят к раскрытым формам. К складчатым формам приводят химические взаимодействия в виде дисульфидных мостиков, а также невалентные взаимодействия: водородные связи, гидрофобные, ионные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия.

Наиболее общей вторичной структурой белков является a-спираль. В этой структуре полипептидный остов закручен относительно длинный оси молекулы, а R-группы аминокислотных остатков расположены с внешней стороны спирали. Шаг спирали составляет 0.56 нм. Вторым типом регулярной структуры в белках является b-конформация, которая способствует укладыванию полипептидных цепей в слои, при этом возможно как параллельное, так и антипараллельное расположение цепей. В некоторых белках (например в коллагене) помимо этих регулярных конформаций встречаются и другие типы вторичной структуры: b-складка и b-виток. Хотя фибриллярные белки имеют только один тип вторичной структуры, глобулярные белки могут включать несколько типов вторичной структуры для одной молекулы. Глобулярные белки, включая ферменты, транспортные белки, некоторые гормоны и иммуноглобулины, образуют складчатые структуры, более компактные чем a- и b- конформации.

Третичная структура представляет трехмерное расположение всех атомов в белке, она имеет дело с дальнодействующими взаимодействиями аминокислотных остатков. Свиной альбумин имеет 584 остатка в одной цепи.

Ниже показаны относительные размеры цепи в b-конформации, в форме a-спирали и нативной глобулярной форме.

b - конформация: 200 х 0.5 нм

a - спираль: 90 х 1.1 нм нативная глобулярная форма: 13х3 нм

Пространственное расположение атомов в кристаллической решетке белка определяют методом рентгеноструктурного анализа исходя из углов и интенсивности дифракций от электронных оболочек атомов. К настоящему времени этим методом установлены третичные структуры сотен глобулярных белков (миоглобин, инсулин, цитохром с, лизоцим, рибонуклеаза и т.д.).