В качестве источников питания возбудитель кокцидиоидомикоза использует моно-, ди- и полисахариды, окисляя, но не сбраживая их. Растет на средах с солями молочной и уксусной кислот, но при этом рост сильно угнетен; лимонную, щавелевую и виннокаменную кислоты практически не усваивает; клетчатку не разлагает. Хорошо развивается на средах, содержащих олеиновые кислоты, свиной жир, оливковое масло; использует этиловый спирт. Растет на белковых субстратах, свернутой сыворотке, на кровяном агаре, нередко с гемолизом; усваивает пептон и многие аминокислоты: аспарагин, цистин, аланин; глицерин и др.; растет на средах с мочевиной, сульфатом или хлоридом аммония. Протеолитическая активность гриба довольно яркая: он интенсивно разжижает желатин и казеин, свернутую лошадиную сыворотку; пептонизирует и коагулирует молоко. Не восстанавливает нитраты в нитриты; не образует индола и сероводорода. Гриб растет на минеральных питательных средах с различными источниками азотистых веществ и углерода; развивается на водных вытяжках из различных образцов почвы, растет на овощах и увлажненных кусочках дерева. Дрожжевой экстракт как единственный источник питания в агаровых средах стимулирует рост и более раннее образование артроспор.
Гриб устойчив к воздействию практически всех антибактериальных антибиотиков. Это свойство используют в практической микологии для освобождения от микробной флоры подлежащих исследованию объектов внешней среды и материала от больных.
Оптимальным рН для гриба является 6,8, но диапазон, при котором он растет, варьирует от 6,5 до 7,4. Температура инкубации также может колебаться от комнатной до 41 0С, оптимум – 25-30 0С, однако, даже при 4 0С отмечается медленный рост гриба и созревание артроспор.
В мицелиальной фазе роста гриб является аэробом, но может расти и в условиях недостатка кислорода (факультативный анаэроб). В тканях организма хозяина при отсутствии атмосферного кислорода тканевая форма гриба проявляет свойства микроаэрофила, для которого достаточно того количества кислорода, которое доставляется в ткани гемоглобином крови. При культивировании тканевой формы гриба in vitro предпочтительной является инкубация в атмосфере, содержащей от 20 до 40 % углекислого газа.
Грибы рода Coccidioides включены в число потенциальных агентов биотерроризма. В то же время, значимость возбудителей кокцидиоидомикоза как агентов биотерроризма снижается в связи с тем, что большинство случаев инфицирования заканчивается выздоровлением, инкубационный период (обычно 10-16 дней) слишком продолжительный, не существует вакцин для защиты тех, кто может использовать эти микромицеты в качестве объектов биотеррора. Тем не менее, существует мнение о возможности использования артроконидий Coccidioides как векторов доставки опасных биотоксинов.
Факторы патогенности гриба до сих пор изучены недостаточно. Физические и химические свойства самой клетки гриба (артроспоры) обеспечивают возможность ее проникновения глубоко в альвеолы, а наличие «усиков, орнамента» у спор способствует их фиксации на клетках альвеолярного эпителия.
Наличие в клеточной стенке мицелия и артроспор большого количества хитина и липидов при сравнительно большой величине клеток обеспечивает гидрофобность клеточной стенки гриба, что затрудняет захват и переваривание (в связи с отсутствием в организме млекопитающих фермента хитиназы) фагоцитированных клеток. Эти же факторы обусловливают длительную персистенцию гриба в тканях. Вследствие незавершенности фагоцитоза скорость репродукции гриба в организме (конверсия в сферулы) превышает скорость его переваривания. Кроме того, в составе клеточной стенки тканевой фазы возбудителя кокцидиоидомикоза обнаружены адгезины, которые являются одним из факторов вирулентности этого гриба. Клеточная стенка содержит белки, обладающие иммуносупрессивным действием, что приводит к подавлению синтеза гуморальных антител.
Протеолитические ферменты Coccidioides, в частности протеиназы, использующие в качестве субстратов коллаген, эластин и лецитин, способствуют внедрению и распространению возбудителя, вызывая локальные разрушения тканей, подавляя иммунные реакции макроорганизма, а также лизируя оболочки зрелых сферул и окружающую ткань во время высвобождения эндоспор. Кроме того, в экстрактах клеток гриба обнаружена активность изоцитратлиазы и малатсинтетазы – основных ферментов глиоксилатного цикла, которые способствуют прорастанию артроспор при вегетативном цикле размножения гриба. Клеточная стенка Coccidioides содержит ряд гидролаз, которые обеспечивают конверсию артроспор в сферулы в организме млекопитающих.
Грибы рода Coccidioides, как и другие диморфные микромицеты, способны выделять белки, которые связывают половые гормоны, прежде всего эстроген.
Истинных токсинов у гриба не найдено, однако токсические свойства мицелиальной и тканевой форм гриба выявлены при его введении внутрибрюшинно белым мышам в смеси с 5 % муцина. У возбудителя кокцидиоидомикоза обнаружено цитолитическое, цитотоксическое действие на клеточные элементы крови, лейкоциты периферической крови; токсическими для белых мышей при введении с муцином оказались культуральный фильтрат гриба и полисахарид, извлеченный из него, различные типы кокцидиоидинов (мицелиальный и сферульный). Установлены токсические свойства входящих в состав Coccidioides липидов, экстрагированных этанолом, которые вызывали гибель белых мышей. Токсичными оказались и липиды, извлеченные смесью этанол-хлороформ.
3.1.2 Морфологические и культурально-биохимические свойства Histoplasma capsulatum
В естественных условиях обитания, а также в лабораторных условиях при 25-27 °С гриб растет в виде септированного, многоклеточного мицелия диаметром от 1 до 5 мкм. Молодой мицелий гомогенный, по мере старения в нем становятся видны вакуоли и жировые включения. Через 5-10 дней после посева в зависимости от штамма, состава питательной среды и условий культивирования начинается споруляция. Образующиеся споры бывают двух типов: макро- и микроконидии. Макроконидии – крупные (до 15-25 мкм) шиповатые или бугристые, сферические или грушевидные споры. Они образуются в воздушной части мицелия обычно на конце его коротких отростков, но могут быть сидящими на конце длинной гифы. Бугорки или шипики макроконидий имеют длину от 1 до 5-8 мкм. В субстратной части мицелия преобладают макроконидии, не имеющие бугристости. В слое мицелия, вросшем в агар, иногда отмечается образование спор, тело которых окружено ободком субстанции. Это так называемые нимбоспоры.
Другим типом спор, образуемых H.capsulatum, являются микроконидии. Это обычно гладкостенные споры сферической, грушевидной или сигарообразной формы, 2-6 мкм в диаметре, расположенные на короткой боковой гифе терминально. Иногда в культуре можно наблюдать небольшое количество микроконидий, которые в точности воспроизводят по внешнему виду макроконидии, за исключением размера.
Споруляция H.capsulatum зависит от штамма, условий выращивания и состава питательной среды. Одни штаммы продуцируют преимущественно макроконидии, другие на этой же среде – микроконидии. У некоторых штаммов градация размера от микро- к макроконидии изменяется так постепенно, что четкого разграничения между ними сделать нельзя. Штамм, который продуцирует гладкие макрокониидии на одной среде, может образовывать бугристые – на другой. В общем, преобладают мелкие споры, диаметром менее 5 мкм. Они наиболее легко проникают в альвеолы и, конверсируя в дрожжевую фазу, вызывают заболевание. Все первичные изоляты H.capsulatum можно разделить на 2 типа: Albus – белый, с преобладанием гладких макроконидий и широким воздушным мицелием и Brown – коричневый, с массой типичных окрашенных бугорчатых макроконидий. Последние – характерный специфический признак H.capsulatum. Промежуточные типы (С и Д) встречаются реже.
Почти все штаммы гриба при первичном выделении из клинического материала образуют типичные бугристые макроконидии, что очень важно с точки зрения диагностики. При длительном культивировании музейных штаммов гриба на одной и той же питательной среде происходит потеря этого морфологического признака. Это затрудняет идентификацию выросших культур. Предложены разнообразные способы стимулирования продукции бугристых макроконидий. Среди них наиболее часто используют пересев культуры на картофельный агар с 2 % глюкозы, агар Сабуро с фосфорно-кислыми солями натрия или калия. Цельная кровь, температура инкубации выше 30 0С отрицательно влияют как на рост, так и споруляцию мицелиальной фазы. Оптимальным является рН 6,5-7,5. Споруляция может быть усилена добавлением к питательным средам углеводов и источников азота. На среде с углеводами в присутствии аспарагина наблюдается обильное макроконидиальное спороношение, в присутствии KNO3 отмечается наличие спор обоих типов, в присутствии же сульфата аммония преобладают гладкостенные макроконидии и микроконидии. Восстановление формирования типичных бугристых макроконидий может быть достигнуто пересевом культуры на среды, содержащие экстракты из перьев птиц, в стерильную почву или пассажем культуры через организм восприимчивых животных (мыши, золотистые хомячки).
Дрожжеподобная фаза гриба in vitro может быть получена лишь выращиванием при 37 0С на специальных питательных средах, содержащих цистеин. Колонии гриба имеют беловатую, желтоватую или кремовую окраску. Они выпуклой формы, имеют пастообразную консистенцию. Поверхность колоний гладкая, морщинистая, церебриформная, в зависимости от возраста культуры. Зрелые колонии обычно формируются спустя 7-10 сут после посева из клинического материала. Под микроскопом – клетки молодой культуры дрожжеподобной фазы. Это овальные тельца овоидной формы 1,5-2,0 х 3,0-3,5 мкм. У активно растущих клеток один полюс заострен. Почки могут образовываться на одном из двух полюсов, реже аполярно. Из каждой материнской клетки могут образовываться до 3 почек, они повторяют ее форму, имеют ясно выраженную оболочку, но меньше размером.