Дрожжеподобная фаза гриба, полученная in vitro, не совсем идентична форме, паразитирующей в тканях хозяина. Клетки последней меньше, чем полученные в культуре. Величина клеток, в зависимости от способа окраски, варьирует от 1 до 4 мкм в диаметре.
Мицелиальная фаза гриба слабо активна в биохимическом отношении. Она очень медленно (и не всегда) разжижает желатин, не разлагает целлюлозу, не гидролизует альбумин, не изменяет молоко, не образует сероводорода, ацетона или индола, но восстанавливает нитраты в нитриты и гидролизует жиры.
Дрожжеподобная фаза при росте на углеводах не образует ни кислоты, ни газа, но восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индола, не гидролизует крахмал, целлюлозу и не действует на молоко. В общем, дрожжевая фаза более требовательна к составу питательной среды, чем мицелиальная. Зависимость ее от содержания в среде серусодержащих аминокислот позволяет заключить, что она не способна к синтезу этих веществ, являющихся для нее факторами роста.
Ферментативная активность возбудителя гистоплазмоза вряд ли может быть использована в практических целях. Тем не менее, на основании изучения группы гидролитических ферментов показано, что возбудитель гистоплазмоза не обладает плазмокоагулирующей способностью, не проявляет фибриногенолитической активности, но медленно гидролизует азоколл – денатурированный коллаген, который широко используется для определения протеолитической активности таких ферментов, как трипсин, панкреатин и коллагеназа.
Патогенность H. capsulatum, в первую очередь, обусловлена химическим строением клеточной стенки. Наличие в клеточной стенке мицелия и спор гриба большого количества хитина и липидов обеспечивает гидрофобность клеточной стенки возбудителя, что затрудняет захват и переваривание (из-за отсутствия в организме млекопитающих фермента хитиназы) фагоцитированных клеток гриба, и обусловливает незавершенность самого фагоцитоза с вытекающими из этого последствиями (как и при кокцидиоидомикозе). Полисахариды, входящие в состав клеточной стенки H. capsulatum, в частности α-1,3-глюкан также играют важную роль в патогенезе гистоплазмоза.
Одним из главных факторов патогенности H. capsulatum, так же, как и у других диморфных грибов, является способность к образованию тканевой формы, которая более устойчива к действию антимикотиков. Наиболее значимыми стимулами конверсии H. capsulatum в дрожжевую фазу считаются сульфгидрильные группы, представленные цистеином или другими аминокислотами в составе различных белков.
Особенный интерес представляют механизмы защиты гриба от лизиса внутри макрофагов. Клетки H. capsulatum способствуют снижению кислотности среды внутри фаголизосомы до уровня, подавляющего активность кислых гидролаз, но при этом не влияющего на количество ионов железа, необходимых для роста возбудителя.
Кроме того, в составе клеточной стенки возбудителя гистоплазмоза обнаружены адгезины, которые являются одним из факторов патогенности этого гриба. Клеточная стенка также содержит белки, обладающие иммуносупрессивными свойствами, что приводит к подавлению ответных иммунологических реакций.
Истинных токсинов у возбудителя гистоплазмоза не найдено, однако вирулентность обеих фаз гриба повышается при его внутрибрюшинном введении белым мышам в смеси с 5 % муцина. У возбудителя гистоплазмоза обнаружено цитолитическое, цитотоксическое действие на клеточные элементы крови, лейкоциты периферической крови.
Размер спор возбудителя гистоплазмоза играет немаловажную роль в патогенезе заболевания. Микроконидии проникают глубоко в альвеолы, тогда как макроконидии чаще выводятся из дыхательных путей их мерцательным эпителием. Наличие у конидий шипов способствует их фиксации на клетках альвеолярного эпителия.
3.1.3 Морфологические и культурально-биохимические свойства Blastomyces dermatitidis
В природных условиях и при комнатной температуре (20-25 °С) на среде Сабуро с глюкозой вырастают колонии мицелиального типа. Они полиморфны, наряду с куполообразно приподнятыми складчатыми и кожистыми встречаются мучнистые, бархатистые и даже с выраженным воздушным мицелием на поверхности. Окраска их вначале белая, позднее коричневатая. Основание колоний плотно спаяно с питательной средой. Пигмент в среду не диффундирует. При микроскопии в кожистых колониях обнаруживается широкий септированный мицелий, множественные ветвления, обилие спор. Мучнистые варианты имеют конидии круглые, вытянутые, одиночные, сидящие на конидиеносцах.
При пересеве мицелиальной культуры на мясо-пептонные среды с глюкозой и инкубировании при 37 °С вырастают (сразу или в пересевах) гладкие культуры, иногда мозговидные, похожие на дрожжевые. Цвет их вначале беловато-желтый, позже — коричневатый. По мере старения поверхность колоний становится морщинистой, неровной, радиально исчерченной или петлистой. При микроскопии наряду с мицелиальными элементами обнаруживаются дрожжеподобные клетки, аналогичные таковым в пораженных тканях.
Тканевая (паразитарная) фаза имеет вид дрожжеподобных клеток диаметром до 15 мкм и толщиной стенок от 0,5 до 0,75 мкм. Некоторые клетки почкуются, но имеют одну дочернюю клетку и очень редко 2-3. Клетки дрожжевой фазы имеют четко видимую двухконтурную оболочку, в составе которой содержится хитин.
Некоторые авторы выделяют американскую и африканскую разновидность B.dermatitidis. Они не различаются в мицелиальной фазе, но в отличие от американских, африканские штаммы с трудом конверсируют в дрожжеподобную на искусственных питательных средах.
Биохимические свойства B. dermatitidis изучены слабо, так как они вариабельны и поэтому редко используются для его видовой идентификации.
Главными факторами патогенности, как и у других диморфных грибов, являются хитин и α-глюканы клеточной стенки. Кроме того, известен адгезин, который к тому же считается основным антигеном, вызывающим клеточные и гуморальные реакции. Это белок клеточной стенки WI-1, образующийся только в дрожжевой фазе.
3.1.4 Морфологические и культурально-биохимические свойства Paracoccidioides brasiliensis
Гриб неприхотлив в выборе питательных сред. В мицелиальной фазе он растет на обычных средах с углеводами, на кровяном и сывороточном агаре, на моркови с глицерином, а также на синтетических средах с углеводами и аминокислотами. При комнатной температуре гриб развивается медленнее, чем при 37 °С. В первоначальных посевах патологического материала рост несколько более замедлен, чем при пересеве лабораторных штаммов. При комнатной температуре одномесячные культуры представляются складчатыми, в центре покрыты беловато-сероватым пушком.
Мицелий септированный, конидии овальные на коротких конидиофорах. В старых культурах обнаруживаются крупные хламидоспоры. Вид гриба под микроскопом очень похож на
возбудителя бластомикоза. Некоторые культуры образуют на агаре Сабуро красный пигмент, исчезающий через несколько недель.
В инфицированных тканях гриб растет в виде дрожжевой фазы, представленной сферическими почкующимися клетками размером от нескольких до 30 (редко 60) мкм в диаметре. Стенка клеток плотная, толщиной от 0,2 до 1 мкм в диаметре в зависимости от возраста. Почка может появиться в любой точке поверхности клетки, не изменяя ее сферической формы. Она соединена с родительской клеткой с помощью тонкого перешейка. Это явное отличие от возбудителя бластомикоза, где почкующаяся клетка имеет слегка овальную форму, с одной или несколькими почками, соединенными с родительской клеткой с помощью широкой соединительной поры. Стенки родительской клетки и почки тоньше, чем у В. dermatitidis. Почки легко отделяются от родительской клетки. Их может быть несколько, а иногда родительская клетка имеет как бы корону из почек, что является важным диагностическим признаком этого гриба.
Конверсия мицелиальной фазы в дрожжевую происходит как на средах, богатых белком, так и на простых питательных средах. Обязательным условием является лишь температура 37 °С.
Гриб в культуре биохимически мало активен, поэтому для его идентификации пробы на усвоение и ферментацию питательных веществ не рекомендуются.
К основным факторам патогенности P. brasiliensis относят глюканы клеточной стенки, в первую очередь, α-1,3- глюкан, а также β-глюканы, которые, предположительно, защищают возбудитель от распознавания иммунокомпетентными клетками макроорганизма и влияют на образование ряда цитокинов. Важным фактором патогенности является внеклеточный белок gp-43, обладающий протеиназной активностью и способностью связываться с ламинином, за счет которого происходит адгезия к базальной мембране в организме человека.
Немаловажная роль в патогенезе паракокцидиоидомикоза принадлежит эстроген-связывающему комплексу. Действие эстрогенов препятствует переходу гриба в инвазивную дрожжевую фазу, что связывают с устойчивостью взрослых женщин к паракокцидиоидомикозу.
4 Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования
Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала от людей и из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».