4.1 Взятие материала от человека
Для исследования может быть взята практически любая ткань или биологическая жидкость из организма человека. Наиболее часто материалом для исследования служат мокрота, смывы с бронхов, плевральный выпот, соскобы и гной из кожных очагов и свищевых ходов, кровь, цереброспинальная жидкость, биопсийная ткань.
Мокроту собирают в стерильную баночку с завинчивающейся крышкой или чашку Петри после предварительной обработки полости рта или зева 2 % раствором бикарбоната натрия, буры, стерильным изотоническим раствором хлорида натрия или слабо розовым раствором марганцевокислого калия.
Промывные воды бронхов, придаточных пазух и полостей носа, плевральный экссудат, спинномозговую жидкость (не менее 3 мл) собирают в стерильные пробирки; кровь на гемокультуру (при подозрении на фунгемию) берут в количестве 5-10 мл из локтевой вены; фекалии (последнюю порцию) отбирают в стерильную посуду с завинчивающейся пробкой, также берут и мочу (10-15 мл) после туалета наружных половых органов. Отделяемое язв, свищей можно собирать в стерильные пробирки, а при малом количестве отделяемого материала используют стерильный тампон, пастеровскую пипетку или бактериологическую петлю. Также берут отделяемое наружного слухового прохода, конъюнктивы, отделяемое с других слизистых оболочек.
Кусочки органов, пунктаты костного мозга и биопсийную ткань помещают в 2 стерильные баночки, одну из которых заливают 10 % формалином (гистологическое исследование), а вторую используют для посева (микологическое исследование).
Если исследуемый материал нестерилен, то для подавления роста бактериальной флоры в него необходимо добавить антибактериальные антибиотики широкого спектра действия, а также антифунгальные антибиотики для подавления роста плесневых грибов. Материал с добавленными антибиотиками перед дальнейшим исследованием инкубируют при 37 °С в течение 1ч.
При исследовании мокроты, гноя, кала, в которых в большом количестве содержатся посторонние примеси (лейкоциты, гибнущие тучные клетки, пыльца растений, непереваренные остатки пищи и т.д.), необходимо так называемое «просветление» патологического материала. Для этого используются 10% раствор едкого калия или натрия в смеси с равным количеством патологического материала с последующей их экспозицией в течение 10-15 мин.
Однако следует иметь в виду, что такой обработке может подвергаться только та часть материала, которая не предназначена для посева или заражения животных.
4.2 Взятие материала из объектов окружающей среды и сырья растительного происхождения
Шерсть, хлопок. Для исследования шерсть отбирают из разных мест, не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.
Почва. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения клетками мицелиальной фазы возбудителей особо опасных микозов берут на глубине до 3 см. При этом при заборе проб с больших участков обследуемую площадь разбивают на квадратные участки со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 5 точек по диагонали или 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб. Каждую пробу весом около 100-200 г помещают в мешочек из плотной ткани с завязками или в лабораторную посуду (широкогорлый флакон, банку), закрытую пробкой из такой же ткани. Место отбора проб дезинфицируют раствором хлорной извести, содержащей 5 % активного хлора, инструменты - огнем паяльной лампы.
Вода. Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10-15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли. Объем каждой пробы не менее 0,5 л, общий объем не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют как пробы почвы.
Смывы с объектов внешней среды. Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения грибами с помощью стерильного тампона, смоченного стерильной дистиллированной водой. Площадь смыва одним тампоном около 100 см2. Тампоны затем помещают в пробирки, заливают стерильной дистиллированной водой (15 мл) и закрывают пробкой.
Сельскохозяйственные культуры. Пробы берут как из поверхностных, так и из глубоких слоев равномерно по всей площади. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого объекта (партии) щуп очищают и обжигают огнем паяльной лампы. В лабораторию направляют среднюю пробу, которую составляют из хорошо перемешанных проб данной партии, емкости и т.п. Масса средней пробы должна быть не менее 500 г.
Воздух. Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов, снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами. Объем исследуемого воздуха должен составлять не менее 3-5 м3.
Для исследования методом ПЦР отбор проб осуществляют так же, как и для бактериологических исследований. Для анализа могут быть использованы пробы из объектов окружающей среды, шерсти, хлопка, зерна, почвы, воды, смывов с поверхностей.
4.3 Направление материала на исследование
Транспортирование и хранение биологического материала для исследования методом ПЦР должны осуществляться с соблюдением «холодовой цепи»: образцы цельной крови – при температуре 2-8 °С – в течение 1 сут; образцы плазмы и сыворотки крови – при температуре 2-8 °С – в течение 5 сут, при температуре минус 70 °С – длительно.
Образцы остальных видов биологических материалов – при температуре 2-8 °С – в течение 1 сут, при температуре минус 20 °С – в течение 1 недели, при температуре минус 70 °С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Патологический материал для исследования помещают в стерильную посуду (пробирки, банки или другую лабораторную посуду). Высушенные на воздухе мазки кладут в стерильные чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой с надписью «мазок не фиксирован». В направлении к материалу от больного человека или трупа указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия материала, его наименование и предположительный диагноз. Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки (кроме проб почвы), которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Допускается использование одноразовых стерильных или многоразовых автоклавируемых пластиковых флаконов. Все пробы нумеруют, емкости заворачивают в лигнин или гигроскопическую вату в количестве, достаточном для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Пробы упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись «верх, осторожно». Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте.
В сопроводительной к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала. Для проб шерсти, зерновых и хлопка дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительной прилагают опись с указанием места отбора каждой пробы.
5 Порядок проведения исследований
Все работы по проведению исследования материала, подозрительного на наличие возбудителей особо опасных микозов, проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
Лабораторная диагностика особо опасных микозов требует проведения следующих этапов:
- обнаружение элементов гриба в патологическом материале;
- выделение чистой культуры из патологического материала микологическим или биологическим методами;
- обнаружение антигенов иммунологическими методами;
- выявление и идентификация ДНК грибных патогенов молекулярно-генетическими методами;
- изучение ответных реакций организма с помощью иммуно-серологических и аллергических проб.
Микроскопию исследуемого материала от больных проводят чаще в препаратах по типу «раздавленной капли». Для окраски микробиологических препаратов применяют калькофлуор белый, возможно использование 10% гидроксида калия для просветления патологического материала. Однако гриб, ввиду наличия толстой светопреломляющей оболочки, может быть виден и в нативных препаратах. Дополнительные методы окраски, как правило, применяются при гистологическом исследовании, при этом чаще всего используется гематоксилин-эозин. Иногда для четкой визуализации сферул требуются специфические виды окраски, такие как серебрение по Гомори-Грокотт и PAS-реакция.
В патологическом материале грибы рода Coccidioides обнаруживаются в виде сферул, которые представляют собой крупные, круглые образования, напоминающие спорангии фикомицетов. Стенка их толстая, двухконтурная. Размеры сферул варьируют от 10 до 200 мкм, в среднем, 60-80 мкм. В зависимости от стадии развития сферулы могут быть пустыми или содержащими эндоспоры (2-4 мкм в диаметре).
При микроскопировании материала, полученного из окружающей среды, гриб выглядит как тонкий, септированный, ветвящийся мицелий, боковые ответвления которого дают начало одноклеточным бочковидным артроконидиям (3-4 х 3-6 мкм), чередующимся с пустыми клетками-дизъюнкторами.