Кроме того, из органов брюшной полости необходимо сделать посевы внутренних органов (печень, селезенка) на те же питательные среды. Сроки инкубации и порядок учета результатов аналогичны описанным для микологического метода исследования. Для оценки вирулентности возбудителя целесообразно посеять и кусочки легких, так как находки гриба в них свидетельствует о диссеминации. Выросшую культуру микроскопируют, как описано выше.
Точный диагноз гистоплазмоза основан на выделении и идентификации грибов в культуре или обнаружении типичных внутриклеточно расположенных элементов дрожжевой фазы в тканях, однако для подтверждения диагноза следует добиться конверсии мицелиальной формы с типичной микроскопической структурой, то есть с бугорчатыми макроконидиями и гладкостенными микроконидиями – в дрожжеподобную. Для получения конверсии in vitro мицелий тщательно растирают в ступке с физиологическим раствором. Эту взвесь засевают в несколько пробирок с агаром Фрэнсиса, которые инкубируют при
37 0С. Для получения чистой культуры в дрожжевой фазе иногда приходится делать от 2 до 5-6 пересевов на ту же среду. Идентификация дрожжевой фазы производится получением конверсии ее в мицелиальную, для чего применяется инкубация при 25-30 °С на агаре Сабуро с фосфорнокислыми солями или на картофельном агаре с 2 % глюкозы и изучение патогенности для биопробных животных с повторным получением чистой культуры гриба в двух фазах.
При диагностике бластомикоза биологический метод имеет меньше преимуществ перед получением культуры, чем при кокцидиоидомикозе или гистоплазмозе. B. dermatitidis патогенен для мышей, но в сроки от 3-4 недель в брюшной полости образуются только мелкие абсцессы без генерализации заболевания. Мышей забивают через 3-4 недели, исследуют гной и делают его посев из любых мелких абсцессов, найденных в брюшной полости. Они обычно бывают в сальнике, вблизи поджелудочной железы и часто припаиваются к брюшине, печени, селезенке или находятся в области таза. Патогистологическое исследование для диагностики бластомикоза используется редко, так как оно не имеет никаких преимуществ перед микроскопией и получением культуры в чистом виде.
P. brasiliensis не является высоко патогенным для лабораторных животных, поэтому биологический метод диагностики паракокцидиоидомикоза используется чаще в научных, нежели в практических целях.
5.4 Иммуно-серологические методы исследования
5.4.1 Кокцидиоидомикоз
Для проведения иммунодиагностических исследований используют МФА, РНГА, РИД, РЛА, РСК и ИФА.
Метод флуоресцирующих антител является одним из наиболее чувствительных и достоверных методов обнаружения возбудителей особо опасных микозов в различных объектах исследования. С помощью МФА предварительный ответ может быть получен в течение 1-2 час от начала исследований нативного материала.
Для постановки МФА используются «Иммуноглобулины флуоресцирующие кокцидиоидные сухие», приготовленные на основе антител кроличьих сывороток против артроконидий (артроспор) Coccidioides. Они обладают группоспецифическими свойствами, взаимодействуя с возбудителями кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза, бластомикоза и паракокцидиоидомикоза. Чувствительность МФА – 1х105 клеток/мл по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследование материала проводится согласно инструкции по применению препарата.
Для обнаружения антигенов Coccidioides spp. используют РНГА с эритроцитарным диагностикумом («Диагностикум эритроцитарный кокцидиоидозный иммуноглобулиновый сухой»). Диагностикум представляет собой формализированные танизированные эритроциты, нагруженные иммуноглобулинами М противококцидиоидных сывороток. Препарат предназначен для обнаружения артроспор Coccidioides в пробах из объектов внешней среды. Чувствительность РНГА составляет 1x104 - 1x105 кл/мл по подсчету в камере Горяева или 5х106 – 5х107 кл/мл по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследование материала проводится согласно инструкции по применению.
Самым простым и доступным методом определения антител (IgM и IgG) считается РИД. Преимущество РИД состоит в том, что по характеру линий преципитата можно выявить специфические системы антиген-антитело. Однако ее чувствительность невысока – 73%, по сравнению с РСК (75%) и ИФА (87%), к тому же постановка РИД требует длительного периода инкубации – до 4 дней.
РЛА и ИФА являются наиболее чувствительными методами, но возможны ложноположительные результаты, которые должны подтверждаться с помощью РИД.
РСК и ИФА, отличающиеся значительной трудоемкостью, находят ограниченное применение в практических лабораториях. Тем не менее, ИФА обладает наибольшей чувствительностью, особенно в период ранней инфекции, в то время как использование РСК и РИД предпочтительно в более поздний период развития кокцидиоидомикоза.
Прогнозировать развитие инфекции позволяют количественные тесты, в первую очередь РСК, с помощью которой определяют уровень IgG. Нарастание количества IgG или титры IgG 1:32 и выше указывают на активность инфекционного процесса и возможность развития диссеминированной формы кокцидиоидомикоза. Однако IgG могут отсутствовать у иммунокомпрометированных пациентов, таких как больные СПИД, сахарным диабетом или больные, получающие иммуносупрессивную терапию. Кроме того, существующие коммерческие тест-системы могут существенно отличаться по чувствительности и специфичности. В связи с этим результаты серологических исследований требуют подтверждения другими методами лабораторной диагностики, и, в первую очередь, культуральным.
Для диагностики кокцидиоидомикоза имеются зарубежные коммерческие тест-системы:
- тест-система для выявления антикокцидиоидных антител путем агглютинации частиц латекса (Coccidioides latex agglutination system) и реакции иммунодифузии (Meridian, Bioscience, Inc., USA).
- тест-система для количественного определения IgM и IgG-антител к кокцидиоидным антигенам (TP, СF) в твердофазном иммуноферментном анализе (Premier™ Coccidioides EIA, Meridian, Bioscience, Inc., USA).
-тест-система определения методом двойной иммунодиффузии сывороточных антител к микромицетам рода Coccidioides (Hyland– Coccidioidomycosis immunodiffusion test).
5.4.2 Гистоплазмоз
Для диагностики гистоплазмоза широко используются такие методы как МФА, РСК, РИД, ТИФА и иммуноблотинг.
В качестве антигенов в серологических тестах обычно используют гистоплазмин или компоненты, выделенные из культурального фильтрата мицелиальной фазы, а также целые дрожжевые клетки.
Существующие трудности интерпретации результатов серологических тестов связаны с наличием общих антигенов Н. capsulatum, В. dermatitidis и Coccidioides spp.
В настоящее время имеется коммерческая тест-система для выявления преципитирующих антител при гистоплазмозе - HP-test latex histoplasmin reagent (HP-test, «Hyland»).
Для диагностики гистоплазмоза используют реакцию преципитации в агаре. Преципитины появляются в начале болезни, на 2-3 неделе, сохраняются 4-6 недель. В качестве антигена в реакции преципитации обычно применяют гистоплазмин или его фракции. Для идентификации полос преципитации необходим контроль с заведомо положительной референс-сывороткой. Обнаружение линий преципитации к двум важным диагностическим антигенам H. capsulatum – H и М, один из наиболее широко доступных методов для диагностики. Специфичность этого теста составляет 70 - 100 %.
Реакция связывания комплемента (РСК) является более чувствительной, чем реакция преципитации (70 - 90 %), но менее специфичной (70 - 80 %). В качестве антигенов в данной реакции можно использовать как цельные клетки дрожжевой фазы, так и гистоплазмин. Следует отметить, что при использовании любых антигенов они дают перекрестные реакции с сыворотками от больных другими микозами (бластомикоз, кандидоз, кокцидиоидомикоз, паракокцидиоидомикоз). Антитела появляются на 3-6 неделях после инфицирования H. сapsulatum у 95 % пациентов с диагнозом гистоплазмоза, и повторные тесты дают положительные результаты в течение многих месяцев. Титры между 1:8 и 1:16 считаются слабоположительными и определяются в почти в 25 % случаев. Однако эти титры антител могут свидетельствовать о прошедшей инфекции или обнаруживаться в сыворотках здоровых людей из эндемичных по гистоплазмозу регионов. Высокие титры (1:32 и больше) или четырехкратное увеличение титра в течение времени – показатель острого гистоплазмоза.
При постановке ИФА используют различные антигенные препараты (гистоплазмин, экстракт дрожжевых клеток). Чувствительность составляет 45% - 100% в зависимости от длительности заболевания.
Методы, основанные на обнаружении антигенов, в ряде случаев могут быть более эффективными, чем выявление антител (при диагностировании гистоплазмоза в острой фазе, при диссеминированном гистоплазмозе у пациентов с ВИЧ-инфекцией). Антигены можно обнаружить при исследовании крови, плевральной, бронхоальвеолярной и цереброспинальной жидкостей, в моче.
Для обнаружения и идентификации антигенов H. capsulatum в мокроте и в тканях органов используют МФА и ИФА.
5.4.3 Бластомикоз
Для серологической диагностики бластомикоза используются РИД, РСК, а также различные варианты реакции РНГА и РЛА. Чувствительность РИД составляет 80%, тогда как РСК лишь 50%. Для идентификации полос преципитации необходим контроль с заведомо положительной референс-сывороткой. Тем не менее, отрицательный результат обеих реакций не исключает диагноз бластомикоза.
Широко используется в различных иммунологических реакциях референс-сыворотка, приготовленная на основе видоспецифического, так называемого А-антигена. Очищенный А-антиген состоит из 5 больших гликопротеиновых комплексов. Из этих компонентов только 2 связаны с А-антигенной активностью возбудителя бластомикоза. РИД с А-антигеном в настоящее время применяют как для идентификации культур возбудителя бластомикоза, так и для обнаружения антител в сыворотках больных. Более точный диагноз может быть поставлен при сочетанном использовании РИД и РСК.