Для иммунодиагностики бластомикоза используют различные модификации ИФА как с А-антигеном, так и антигенами дрожжевой фазы гриба. Для мечения антител применяют преимущественно щелочную фосфатазу, однако хорошие результаты получены и при метке уреазой. При сравнительной оценке чувствительности ИФА, РСК и РИД со взвесью дрожжевых клеток в качестве антигена показано, что чувствительность первого метода превосходила таковую РСК и РИД. Однако отмечено наличие у некоторых штаммов возбудителя бластомикоза антигенов, реагирующих перекрестно с сыворотками больных гистоплазмозом.
В работах зарубежных исследователей показана перспективность использования антигенов клеточной стенки дрожжевой формы B. dermatittidis (BAD1 и α-(1,3)-глюкан) для разработки диагностических тест-систем.
5.4.4 Паракокцидиоидомикоз
Наиболее часто применяются РИД и иммуноэлектрофорез с различными антигенами мицелиальной или дрожжевой фаз.
Для выявления антител у больных легочной формой может быть использован метод подавления твердофазного иммуноферментного анализа, основанный на выявлении молекул антигенов 43 кДа и 70 кДа в бронхоальвеолярном лаваже, а также дот-блот-анализ как альтернатива ИФА для выявления 27кДа рекомбинантного антигена.
5.5 Молекулярно-генетические методы исследования
В качестве альтернативных способов выявления и идентификации грибных патогенов в последнее время все более активно используются молекулярно-генетические методы.
Работу выполняют в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1794 – 03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».
5.5.1 Обеззараживание проб для исследования методом ПЦР
Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность возбудителями особо опасных микозов, проводится в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
Отобранные для исследования пробы могут быть инактивированы следующими способами:
А) Для обеззараживания предварительно подготовленного нативного материала в пробирки с тестируемыми образцами добавляют раствор мертиолята натрия до конечной концентрации 1:1000 и прогревают на водяной бане при температуре (56±1) 0С в течение 40 мин и далее инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч.
К пробам крови добавляют раствор мертиолята натрия (до конечной концентрации 1:1000) и выдерживают при комнатной температуре 24 ч.
Б) Обработка лизирующим буфером, содержащим гуанидинтиоцианат Na и фенол.
К пробе объемом 0,1 мл добавляют 600 мкл лизирующего раствора, содержащего 6 М гуанидинтиоцианат натрия и фенол (приложение 2), забуференный Tris-HCl, pH 8,0 (в соотношении 1:1), и перемешивают на вортексе в течение 10 с. Затем инкубируют при 95 0С в течение 30 минут. Для этого используют микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с защелкой.
Обработанные таким образом пробы считаются обеззараженными и всю последующую работу проводят как с незаразным материалом.
Для проведения этого этапа и дальнейшего выделения ДНК готовят необходимые реактивы (приложение 2).
5.5.2 Выделение ДНК
На этапе обработки лизирующим раствором используют микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с защелкой.
Выделение ДНК из чистых культур микромицетов после обеззараживания проб осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом. Подготовленные пробы в объеме 100 мкл смешивают с 600 мкл лизирующего буфера, содержащим 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата натрия и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0, и перемешивают на вортексе в течение 10 с. Для лизирования клеток грибов пробы инкубируют в течение 30 мин при температуре 95 0С. После этого образец центрифугируют на микроцентрифуге при 12000 об/мин в течение 10 с для осаждения конденсата. Затем к пробе добавляли 300 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют в течение 5 мин при 12000 об/мин. После центрифугирования верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и добавляют 0,1 объема 3M ацетата натрия и равный объем изопропанола для осаждения ДНК. Смесь перемешивают и выдерживают 1 час при –20 0С. После осаждения ДНК пробы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин, отбирают супернатант. Осадок дважды промывают 500 мкл раствора для отмывки 1, содержащего 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 70 % этанола. После этого осадок высушивают при температуре 60 0С в течение 10 мин и растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера. Супернатант используют для постановки ПЦР.
Выделение ДНК из проб почвы и воды проводится путем гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции. Подготовленные пробы почвы и воды в объеме 100 мкл смешивают с лизирующим буфером, содержащим 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата натрия и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0, лизис клеток проводят при 95 0С в течение 30 мин. После этого образец центрифугируют на микроцентрифуге при 12000 об/мин в течение 10 с для осаждения конденсата.
Затем к пробе добавляют 300 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют на микроцентрифуге при 12000 об/мин в течение 5 мин, после чего верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и экстрагируют равным объемом хлороформа. Этот этап повторяют 2 раза. Центрифугируют в течение 5 мин при 12000 об/мин.
Далее верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и добавляют 20 мкл раствора сорбента, содержащего 10мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 10 мкг сорбента SiO2, который предварительно тщательно перемешивают на вортексе. Пробы инкубируют при температуре 60 0С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе для лучшей сорбции ДНК.
Затем пробы центрифугируют при 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с, отбирают супернатант, а к осадку добавляют 100 мкл 4 М раствора гуанидинтиоцианата натрия. Содержимое перемешивают до гомогенного состояния в течение 10-20 с на вортексе, центрифугируют на микроцентрифуге в том же режиме и отбирают супернатант. К осадку добавляют 500 мкл раствора для отмывки 1, содержащего 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 70 % этанола, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Процедуру отмывки повторяют, после чего осадок высушивают при температуре 60 0С в течение 10 мин. Для растворения ДНК к осадку добавляют 100 мкл ТЕ-буфера, выдерживают при температуре 60 0С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. По окончании процедуры десорбции взвесь центрифугируют при 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 1-2 мин и отбирают супернатант для проведения ПЦР.
Для выделения ДНК возбудителей особо опасных микозов из крови используют такой же метод выделения, как и для экстракции и очистки ДНК из почвы, за исключением того, что перед этапом подсушивания осадок ДНК дополнительно промывают 500 мкл ацетона, перемешивают на вортексе и центрифугируют 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с, после чего высушивают при температуре 60 0С в течение 10 мин и растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера.
При исследовании секционного материала часть биоптата (печень, селезенка, легкое, сердце) массой около 30 мг растирают тефлоновым гомогенизатором в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл с 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата натрия, затем добавляют 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 30 мин при температуре 95 0С. Далее выделение ДНК проводят так же, как и с пробами крови.
5.5.3 Проведение ПЦР для специфической индикации и идентификации возбудителей особо опасных микозов
Для проведения реакции используют тест-системы для выявления ДНК возбудителей особо опасных микозов, разрешенные к применению в установленном порядке, позволяющие проводить учет результатов методами электрофореза в агарозном геле или методом ПЦР в режиме реального времени либо с флуоресцентной детекцией по «конечной точке». Работу проводят в соответствии с инструкциями к диагностическим тест-системам.
Для идентификации грибов рода Coccidioides можно использовать праймеры, предназначенные для выявления интерспейсерных областей рибосомальных генов, участков последовательностей генов 19 кДА специфичного антигена и пролинобогащенного антигена А2, гена макрофагзависимого белка MBP-1 и SOWgp82 гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул данных микромицетов.
Идентификацию H.capsulatum можно проводить на основе праймеров, фланкирующих фрагменты рибосомальных генов, ITS – регионов рибосомальной ДНК, гена mold-specific MS8 protein (MS8), экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе развития гриба и гена calcium-binding protein (CBP1), экспрессия которого происходит в дрожжевой фазе и способствует выживанию клеток в макрофагах человека.
Для выявления B.dermatitidis также используют рибосомальные гены, ITS – регионы, ген WI-1 адгезина и ген вирулентности ВАД1. Обнаружение P. brasiliensis можно проводить с помощью праймеров, фланкирующих фрагменты рибосомальных генов и гена gр 43.
5.6 Идентификация культур на основе фенотипических признаков
5.6.1 Получение микрокультур
По общим правилам готовится любая, подходящая для тест-организма плотная питательная среда и наливается тонким слоем в чашку Петри. После застывания среда разрезается скальпелем, проведенным через пламя спиртовки, на кусочки (блоки) произвольных размеров (в среднем 1х1 см2). Данный блок помещается на стерильное предметное стекло и на него наносится пипеткой маленькая капля заранее приготовленной взвеси исследуемого микромицета. При этом следует учесть, что взвесь должна содержать от 5 до 7 клеток в поле зрения (не более). Блок накрывается стерильным покровным стеклом. Микрокультуру помещают в стерильную чашку Петри, края чашки герметично закрывают и помещают в термостат. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру. Рекомендуется готовить 2-4 микрокультуры одного гриба, поскольку не во всех препаратах выявляется хороший рост и отчетливые морфологические признаки. Перед просмотром микрокультуры производят ее обеззараживание парами формалина в течение не менее одних суток.