«Биоинформатика: современное состояние и перспективы» (стр. 4 из 7)

Поиск и характеристика регуляторных элементов в ДНК. Известно, что человек и мышь очень мало отличаются между собой по набору генов и их нуклеотидной последовательности. Большинство различий между этими двумя видами обусловлены именно особенностями регуляции работы генов. Поэтому, если появятся биоинформатические инструменты, позволяющие с высокой степенью надежности находить регуляторные элементы в геноме и определять, как, при каких условиях и на какие гены они влияют, это позволит сделать существенный шаг в развитии биологии.

Успехи в предыдущих двух пунктах могут быть применены в изучении эволюции и систематики живой природы. Сравнивая геномы разных организмов, при условии, что мы знаем, как каждое из найденных отличий сказывается на функции белка и его концентрации клетке, мы сможем не только построить наиболее точную систему живых организмов, но и глубже понять механизмы биологической эволюции.

Наиболее амбициозной задачей является моделирование биологических систем различного уровня, начиная с клетки и субклеточных систем и заканчивая биосферой в целом. Успехи в этом направлении позволят проводить многие виды биологических экспериментов на таких моделях, а не на реальных биологических объектов. Это, в первую очередь, касается тестирования различных лекарственных и других препаратов, что в настоящее время связано с большими материальными и временными затратами, а также с этическими проблемами.

Глава 2 Методика исследования

Для разработки праймеров для амплификации и секвенирования гена ND6 сначала была найдена его последовательность в базе данных, содержащей информацию о геноме человека. Поисковая система Entrez Pubmed, в которой можно найти нуклеотидную последовательность практически любого гена по его названию, база данных Mitomap, в которой представлена наиболее полная информация о митохондриальном геноме человека, и геномный браузер USCS, позволяющий работать с последовательностью генома человека (все эти ресурсы свободно доступны он-лайн).

Далее, зная нуклеотидную последовательность гена ND6 и прилегающих участков, мы подбирали праймеры для его амплификации. Это можно делать либо вручную, выбирая праймеры и проверяя их свойства, такие как температура плавления, вероятность образования шпилек, гомо- и гетеродимеров, специфичность и т.д. с помощью таких средств, как сервер IDTDNA, либо использовать программу Primer3, которая сама подбирает праймеры к данной последовательности, учитывая заданные требования.

Затем, используя разработанные праймеры, проводили сначала амплификацию, а затем секвенирование данного гена. Хотя здесь также было использовано специальное программное обеспечение, в частности, для программирования секвенатора и для интерпретации полученных с его помощью «сырых» данных, такое применение ИТ не совсем соответствует определению БИ.

Следующий этап, на котором было необходимо применение биоинформатических технологий – это сравнение нуклеотидной последовательности гена ND6 больного Х со стандартной последовательностью. Для этого можно применять любую программу для выравнивания последовательностей ДНК, которая воспринимает как файлы в текстовом формате, так и так и файлы, полученные от секвенатора. Нами для этой цели применялась программа Chromas.

Далее, в тех случаях, если при сравнении стандартной ДНК и ДНК больного Х были обнаружены различия, мы определяли, были ли такие замены описаны ранее. Для этого мы обращались к списку мутаций и полиморфизмов митохондриального генома в базе данных Mitomap. Если такая замена уже описана, то для нее будет приведена ее функциональная значимость (оказывает ли она негативное действие на работу белка, и, соответственно, может ли она быть причиной наблюдаемой клинической картины).

В тех же случаях, когда найденная нами нуклеотидная замена не была ранее описана, мы выясняли, может ли она сказаться на работе белка ND6. Для этого существуют различные программы, мы, в частности, использовали программу SNAP.

Глава 3 Результаты и их обсуждение

Поиск нуклеотидной последовательности гена ND6

Для поиска нуклеотидной последовательности гена ND6 использовались три геномных базы данных. В базе UCSC этого гена не оказалось вовсе, хотя митохондриальный геном в ней представлен и, более того, другие гены ND семейства в этой базе найти можно. Разумеется, для дальнейшей работы эта база данных не использовалась. В базе Mitomap, посвященной исключительно митохондриальному геному человека, также обнаружился недостаток, который делает ее использование для наших целей, хотя и возможным, но крайне неудобным. Дело в том, что этот ресурс не позволяет напрямую по названию гена получить его нуклеотидную последовательность. Вместо этого приходится сначала из списка с названиями всех 37 генов координаты начала и конца нужного нам гена, а затем по этим координатам вручную выделить из всего митохондриального генома (длиной 16569 нуклеотидов) нужный участок.

Рисунок 1 – Результат поиска в системе Entrez Pubmed для запроса “mtnd6”. Вторая запись – ссылка на страницу с информацией о гене ND6 человека.

Наиболее удобным инструментом для поиска необходимой последовательности оказалась поисковая система Entrez Pubmed, осуществляющая поиск по базе данных NCBI, в которой представлены большинство секвенированных на настоящий момент геномов. Работа с поисковой системой проста и удобна: вводим в строку поиска название гена, результат получаем разделенный по группам (статьи, последовательности генов, белков, геномов, структура белков и многое другое), выбираем раздел «гены» (рисунок 1), в этом разделе выбираем ген ND6 нужного нам организма (Homo sapiens). Попадаем на страницу с различной информацией об этом гене (рисунок 2), где в разделе Genomic sequence, перейдя по ссылке Fasta или GeneBank, мы попадаем на страницу (рисунок 3), где представлена нуклеотидная последовательность искомого гена. Важным положительным моментом является то, что данная поисковая система предоставляет возможность изменения координат изображаемого геномного региона. Благодаря этому мы получили последовательность не только самого гена ND6, но и прилегающих к нему с двух сторон участков длиной 100 нуклеотидов, что необходимо для разработки маркеров.

Аминокислотную последовательность белка ND6 довольно легко можно найти в базе Mitomap – в ней после нуклеотидной последовательности всего митохондриального генома приведены координаты и аминокислотные последовательности всех митохондриальных генов.

Рисунок 2 – Изображение участка митохондриального генома человека, содержащего ген ND6.

Таким образом, хотя для работы с митохондриальными генами наиболее полная информация представлена в специализированной базе Mitomap, механизмы поиска в ней требуют улучшения, в частности, в ней не хватает инструмента для поиска нуклеотидной последовательности гена по его названию.

Рисунок 3 – Нуклеотидная последовательность гена ND6.

Подбор праймеров для амплификации гена ND6

Для подбора праймеров к данной нуклеотидной последовательности существует множество программ, в том числе и доступных он-лайн. Для решения нашей задачи мы использовали программу Primer3. Все, что требуется для работы с программой – вставить нуклеотидную последовательность и выделить квадратными скобками ту ее часть, которая является целевой для амплификации. Далее выбираем необходимые параметры праймеров (длина, температура отжига, содержание Г и Ц нуклеотидов, участки матрицы, к которой запрещен подбор праймеров, допустимый уровень самокомплементарности и т.д.) и на выходе получаем наилучшую из пар праймеров, соответствующих данным условиям, а также длину амплифицируемого фрагмента (рисунок 4).

Рисунок 4 – Результат подбора праймеров к гену ND6 с помощью программы Primer3

Далее полученную пару праймеров мы проверили с помощью другой программы (Oligoanalyzer на сайте eu.idtdna.com) для того, чтобы оценить их качество по различным параметрам. Эта программа позволяет определить температуру плавления пары праймер-матрица, стабильность (выраженную в изменении стандартной энергии Гиббса) шпилечных, гомо- и гетеродимерных структур, образуемых данным праймером и их специфичность путем выравнивания с различными геномами с использованием алгоритма BLAST (рисунок 5). Важным преимуществом этой программы перед некоторыми аналогами является то, что вводными данными являются не только последовательность праймеров, но и концентрации других компонентов ПЦР-смеси (в некоторых других программах для расчетов используются стандартные концентрации этих компонентов, и они не могут быть изменены пользователем). В результате проверки обоих праймеров с помощью этой программы было показано, что ни один из них не образует стабильных шпилечных или гомодимерных структур, образующийся гетеродимер также не является стабильным при температуре плавления праймеров, которая оказалась равной температуре, рассчитанной программой Primer3. Более того, оба праймера оказались специфичными в отношении гена ND6 именно человека.

Обе программы хорошо подходят для разработки или оценки качества праймеров. Главное преимущество Primer3 заключается в том, что она автоматически подбирает праймеры для данного участка ДНК, тогда как различные олигоаналайзеры, в том числе и рассмотренный здесь, позволяют только проверить соответствие праймеров определенным требованиям, тогда как выбор праймеров необходимо проводить вручную. Однако стоит отметить, что при некоторых специфических задачах без ручного подбора праймеров обойтись нельзя