хлопчатобумажной ткани (по 2 тест-объекта в конверт). Пронумерованные
тест-объекты помещают в хлопчатобумажные мешочки с максимальными
термометрами и размещают в толще объектов в контрольные точки камеры на
трех уровнях.
После дезинфекции мешочки извлекают из камеры и записывают показания максимальных термометров, а тест-объекты помещают в пробирки с 5 мл питательного бульона.
Инкубирование посевов с тест-объектами проводят при температуре (37 +/- 1) °С в течение 21 сут. при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, СПБ, МПБ). Предварительный учет результатов проводят через 24 - 72 ч, окончательный - через 21 сут. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на каждое время обработки. При наличии роста микроорганизмов проводят сравнение выросшей культуры с тест-микроорганизмом.
В качестве контроля используют контаминированные тест-объекты, которые не помещали в камеру. Контрольные посевы выращивают с использованием тех же питательных сред, что и для опытных тест-образцов. Контрольные посевы и среду контролируют аналогично тест-объектам, которые обрабатывали в камере. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на каждое время обработки.
Контролем эффективности режима обеззараживания вещей в испытуемых дезинфекционных камерах является 100%-ная гибель спор тест-микроорганизмов.
6.6. Исследование спороцидной эффективности ДС
при обеззараживании рук в резиновых перчатках
В качестве тест-микроорганизма используют лиофильно-высушенную
сибиреязвенную сухую вакцину СТИ-1. Готовят споровую суспензию путем
внесения в ампулу с сухой вакциной 2 мл стерильной дистиллированной воды.
После растворения сухой вакцины получают суспензию, содержащую (1,0 - 5,0)
8 3 5 7
х 10 спор/мл, которую разводят до содержания 10 , 10 и 10 спор/мл.
Для устранения посторонней микрофлоры рук, включая запястья и предплечья, испытатели тщательно моют с мылом в теплой проточной воде, затем протирают стерильной марлевой салфеткой и надевают резиновые перчатки.
Поверхность резиновых перчаток, надетых на руки испытателей-добровольцев, контаминируют путем тщательного растирания 1 мл споровой суспензии тремя вышеуказанными разведениями (каждое разведение на одного испытателя). После подсыхания микробной взвеси для контроля исходной обсемененности с поверхности резиновой перчатки тыльной стороны кисти делают смыв стерильной марлевой салфеткой размером 5 х 5 см, смоченной стерильной питьевой водой. Затем салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами и встряхивают 10 мин. Полученный смыв высевают по 0,5 мл в селективную жидкую питательную среду (9,5 мл) в пробирке.
Для обеззараживания поверхности перчаток в сжатую ладонь руки в печатке испытателю-добровольцу наносят 2,5 мл исследуемого спороцидного ДС.
Затем он в течение 10 - 15 с протирает этой порцией дезинфицирующего раствора поверхность перчаток обеих рук, совершая движения рук, которые выполняют при обработке кожи рук антисептиком. После этого такую же операцию проводят, нанося 2,5 мл дезинфицирующего раствора на ладонь второй руки, и засекают по секундомеру начало экспозиции.
После 5 мин. экспозиции делают смыв марлевой салфеткой (5 х 5 см), смоченной соответствующим ДС нейтрализатором, предварительно проверенным на эффективность нейтрализации и статического действия на споры. Салфетку помещают в пробирку с 10 мл стерильного нейтрализатора на 10 мин. Затем салфетку переносят стерильным пинцетом в пробирку с 10 мл стерильной питьевой воды с бусами, встряхивают пробирку 10 мин. в шейкере. Из полученного смыва делают посев по 0,5 мл на селективные жидкие питательные среды в пробирках (не менее 3 пробирок на пробу).
Эффективными считают режим применения ДС, обеспечивающий 100%-ную гибель исследованных спор вакцины СТИ-1 на резиновых перчатках, защищающих кожу рук.
6.7. Исследование спороцидной эффективности ДС,
предназначенных для обеззараживания воды
Методы распространяются на изучение спороцидной эффективности химических ДС при обеззараживании питьевой и природной воды, содержащей или подозрительной на содержание возбудителя сибирской язвы.
При определении спороцидной эффективности ДС в качестве тест-объектов используют водопроводную (дехлорированную), колодезную и речную воды. Водопроводную воду дехлорируют нагреванием при температуре (50 - 60) °С в течение 30 - 40 мин. Определяют физико-химические свойства питьевой дехлорированной воды и образцов природных вод. Кроме того, в последних определяют микробиологические показатели (общее микробное число и общее количество колиформных бактерий).
В качестве тест-микроорганизмов для контаминации исследуемых проб воды используют споровую культуру B. cereus (шт. 96) или сибиреязвенную живую сухую вакцину СТИ-1 для людей. Вирулентную культуру возбудителя сибирской язвы в этих целях использовать не разрешается из-за сложности соблюдения противоэпидемических мероприятий.
Контаминацию изучаемых образцов воды проводят путем внесения споровой
8
культуры B. cereus (шт. 96) в виде суспензии, содержащей 10 спор/мл, а
сибиреязвенную живую сухую вакцину СТИ-1 - в виде суспензии, приготовленной
разбавлением содержимого одной ампулы вакцины в 10 мл стерильного
физиологического раствора или стерильной водопроводной воды до содержания
8 9
10 - 10 спор/мл.
При постановке экспериментов исходную воду наливают в емкости с нижним
тубусом объемом 5 - 10 л и вносят в воду вышеуказанные тест-культуры из
5 6
расчета 10 - 10 спор/л. После тщательного перемешивания определяют
концентрацию исходной контаминации воды. Для этого из емкостей отбирают 1 -
3 пробы воды объемом 3 - 5 мл. Из каждой пробы делают 3 - 4
последовательных десятикратных разведения стерильным физиологическим
раствором или стерильной водопроводной водой, в которых затем определяют
количество тест-микроорганизма в 1 мл пробы воды методом мембранной
фильтрации.
Метод основан на концентрировании микроорганизмов из определенного объема анализируемой воды путем фильтрования через мембранные фильтры, выращивании посевов при температуре (37 +/- 1) °С на плотной питательной среде и подсчете количества тест-микроорганизмов в единице объема воды.
Используют мембранные фильтры для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм или другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющие сертификат качества. Мембранные фильтры готовят к анализу в соответствии с указаниями производителя.
Фильтрование воды проводят с помощью прибора для мембранной фильтрации. Воронку и столик прибора перед анализом воды завертывают в бумагу и стерилизуют в паровом или воздушном стерилизаторе. На нижнюю часть прибора (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр; прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой); закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора; при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем исследуемой воды и создают вакуум в приемном сосуде.
Фильтруют вначале меньшие, а затем большие количества воды через один фильтровальный прибор, каждый раз сменяя мембранный фильтр.
После окончания фильтрования определенного количества воды фильтровальный стакан (воронку) снимают, а фильтр осторожно приподнимают за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишней влаги на нижней стороне фильтра, а затем переносят его, не переворачивая, на поверхность казеинового или мясопептонного агара в чашках Петри так, чтобы между средой и фильтром не было пузырьков воздуха. Под каждым фильтром на обратной стороне дна чашки Петри делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 24 - 48 ч.
По окончании инкубации учитывают количество колоний тест-микроорганизма, выросших на фильтрах, и определяют концентрацию их в 1 л воды по формуле:
k
С = - х N х 100,
v
где:
С - количество спор, содержавшихся в 1 л воды;
k - кратность разведения;
v - посеянный объем воды в мл;
N - среднее арифметическое число колоний, выросших на мембранных фильтрах при посеве одинаковых разведений.
Результат анализа при определении числа спор в исходной воде выражается числом КОЕ в 1 л воды.
Для определения эффективности обеззараживания спороцидным ДС в емкость с водой, контаминированной спорами тест-микроорганизмов, вносят ДС в изучаемых концентрациях, воду тщательно перемешивают. Через заданные промежутки времени отбирают пробы воды объемом 1 л в стерильные флаконы с внесенным стерильным нейтрализатором, подобранным в концентрации, обеспечивающей нейтрализацию действующего агента изучаемого ДС.
В обеззараженной воде определяют число непогибших спор B. cereus или сибиреязвенной живой вакцины СТИ-1 для людей методом мембранной фильтрации. Пробы обеззараженной воды с нейтрализатором должны быть исследованы не позднее чем через 1 ч после их отбора.
На начальных этапах изучения эффективности обеззараживания воды анализируют не менее двух проб, отличающихся по объему в 10 раз, и выбранных так, чтобы на одном фильтре выросло не более 300 колоний. На одну чашку Петри можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы они не соприкасались друг с другом. При анализе обеззараженной воды на конечных этапах обеззараживания необходимо исследовать объем не менее 1 л, профильтровывая это количество не менее чем через 3 - 4 мембранных фильтра.
Посевы инкубируют, как указано выше. Учитывают общее количество выросших КОЕ на фильтрах после фильтрования 1 л воды. Результат анализа выражают числом спор в 1 л обеззараженной воды.
Статистическая обработка результатов микробиологических анализов по оценке эффективности средств обеззараживания воды имеет целью исключить случайные ошибки, оценить отклонения результатов анализа от действительной величины и дать искомые результаты с заданной вероятностью.