Критерием оценки эффективности ДС при обеззараживании воды является отсутствие тест-микроорганизмов в 1 л воды.
6.8. Исследование спороцидной эффективности ДС,
предназначенных для обеззараживания выделений
(моча, фекалии, мокрота, кровь)
Обеззараживание мочи. В качестве тест-объекта используют мочу, которую
разливают в колбы или пробирки по 8 мл, добавляют по 1 мл споровой
9
суспензии, содержащей 2 х 10 спор/мл тест-микроорганизма, и
инактивированной лошадиной сыворотки.
Растворы испытываемого ДС готовят в концентрациях, обеспечивающих спороцидный эффект при испытании его на батистовых тест-объектах с белковой защитой.
Испытуемые концентрации растворов ДС добавляют к моче в равном или двойном объеме. Отмечают время контакта и через интервалы 15, 30, 60 мин. пипеткой берут указанную смесь в количестве 1 мл и переносят в пробирки с 5 мл питательной среды (бульон Хоттингера, pH 7,2) и соответствующего нейтрализатора. После тщательного смешивания 1 мл жидкости из первой пробирки с бульоном переносят во вторую пробирку с бульоном (5 мл) и затем засевают по 0,1 мл на агар Хоттингера (pH 7,2) в чашках Петри как из первой, так и из второй пробирки. Чашки Петри инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °С.
Контролем служат аналогично поставленные опыты, только с добавлением к моче не дезинфицирующего раствора, а воды.
Ориентировочный учет результатов проводят через 1 сут., предварительный - через 5 - 7 сут., окончательный - через 21 сут. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принимают за 100%. Окончательное заключение об эффективности ДС делают на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами.
Эффективным считают средство и режим его применения, обеспечивающие 100%-ную гибель спор тест-микроорганизмов.
Обеззараживание фекалий. При разработке режимов обеззараживания фекалий учитывают соотношение дезинфицирующего средства к обеззараживаемой массе, время обработки, температуру, консистенцию обеззараживаемых выделений, степень гомогенизации в процессе обеззараживания.
Исследования проводят в два этапа. На первом этапе в качестве тест-объекта используют 20%-ную эмульсию фекалий, на втором - оформленные фекалии.
Для приготовления 20%-ной эмульсии 20 г фекалий растирают в ступке и
добавляют 80 мл воды; полученную эмульсию фильтруют через двойной слой
марли, стерилизуют в автоклаве, разливают пипеткой в пробирки по 9 мл и
9
добавляют по 1 мл 2 х 10 спор/мл в суспензии тест-микроорганизма. Опыты
начинают ставить с концентрации, вызывающей гибель тест-микроорганизма в
моче с белком через 30 мин. Приготовленную эмульсию фекалий заливают равным
или двойным по отношению к весу фекалий объемом дезинфицирующего раствора и
в дальнейшем производят высевы так же, как и при обеззараживании мочи.
Результаты учитывают через 48 ч.
При положительных результатах проводят опыты с большим количеством оформленных фекалий (200 - 250 г). Для этого помещают их в сосуд, заливают дезинфицирующим раствором или засыпают сухими дезинфектантами в равном или двойном количестве по отношению к весу фекалий, определяют, происходит ли гомогенизация фекалий. Затем небольшую часть каловых масс размешивают стеклянной палочкой с жидкостью, а остальную массу оставляют в виде небольших комочков. Через определенные промежутки времени (например, 30, 60 мин.) проводят посев.
Посев жидкой части фекалий высевают так же, как и мочу. Плотные же части (комочки) забирают бактериологической петлей и помещают в 5 мл питательной среды с соответствующим нейтрализатором, растерев их о края пробирки и тщательно перемешав. Затем стерильной пипеткой переносят из этой пробирки 1 мл смеси во вторую пробирку, тоже содержащую бульон Хоттингера (pH 7,2). Как из первой, так и из второй пробирки производят посев на агар Хоттингера в чашках Петри (не менее чем в три чашки по 0,1 мл). Окончательный результат учитывают через 7 сут., а предварительный - через 24 ч.
Контролем служат аналогично поставленные опыты с добавлением вместо дезинфицирующего раствора воды. Результаты опытов учитывают по отношению к контролю, который принимают за 100%. Судят об эффективности исследуемого вещества на основании не менее трех опытов с совпадающими результатами. Эффективным считают средство и режим его применения, обеспечивающие 100%-ную гибель спор тест-микроорганизмов в обеззараживаемом материале.
Обеззараживание крови и мокроты. В качестве тест-объектов при оценке
спороцидной эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания крови,
используют кровь, а мокроты - куриный белок. В качестве тест-микроорганизма
используют споры B. cereus (шт. 96). Для контаминации тест-объектов
тест-микроорганизмом к 9 мл 40% крови или 50% куриного белка добавляют по 1
9
мл суспензии тест-микроорганизма, содержащей 2 х 10 спор/мл, перемешивают
и разливают по 1 мл в стерильные флаконы. Затем во флаконы засыпают или
наливают исследуемое ДС в объемных (5%, 10% и т.д.) соотношениях к объему
исследуемого материала. Через определенные промежутки времени (1, 3 ч и
т.д.) с помощью стерильной бактериологической петли производят отбор пробы
смеси и переносят ее в 5 мл селективной жидкой питательной среды с
соответствующим (заранее проверенным по эффективности нейтрализации ДС)
нейтрализатором для нейтрализации остаточного действия ДС на споры
тест-микроорганизма. По истечении 5 мин. экспозиции из этой пробирки с
помощью пипетки производят высев по 0,2 мл исследуемой пробы на агар
Хоттингера (pH 7,2) в чашках Петри. Пробирки и чашки с посевами инкубируют
при (37 +/- 1) °С.
Окончательный результат роста тест-микроорганизмов на чашках учитывают на 3 - 7 сут., а предварительный - через 24 ч, в пробирках через 21 сут. и 24 - 48 ч соответственно.
Эффективным считают средство, обеспечивающее 100%-ную гибель спор тест-микроорганизма в обеззараживаемом материале.
6.9. Исследование спороцидной эффективности ДС,
предназначенных для обеззараживания медицинских отходов
При изучении спороцидной активности ДС с целью разработки режимов
обеззараживания медицинских отходов используют тест-объекты из резин,
пластмасс, текстильных материалов, стекла, металлов. Для приготовления
тест-объектов стерильные одноразовые изделия медицинского назначения
(бинты, ватные тампоны, фрагменты систем для переливания крови и
лекарственных препаратов, катетеры, шпатели, шприцы, иглы, перчатки,
одноразовое белье, салфетки, пипетки, трубки и пр.) измельчают и погружают
9
в суспензию, содержащую 2 х 10 спор/мл B. cereus с 40%-ной
инактивированной лошадиной сывороткой или сывороткой крупного рогатого
скота. После достаточного пропитывания объекты извлекают в сухую стерильную
емкость и подсушивают в термостате в течение 20 мин. или при комнатной
температуре 18 - 20 °С и относительной влажности воздуха 50 - 60% в течение
1 ч.
Контаминированные тест-объекты погружают в емкость с испытуемым дезинфицирующим раствором так, чтобы он полностью закрывал их. Контроль эффективности обеззараживания объектов проводят через каждые 15 - 30 мин. в течение времени от 30 до 360 мин. Для этого тесты из различных материалов (по два каждого наименования) извлекают из дезинфицирующего раствора, промывают в растворе соответствующего нейтрализатора и помещают в пробирки с жидкой питательной средой. Контрольные тест-объекты погружают на срок максимальной экспозиции в стерильную водопроводную воду, а затем в жидкую питательную среду. Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °С. Учет результатов проводят в течение 21 сут.
Критерий эффективности обеззараживания медицинских отходов - 100%-ная гибель спор тест-микроорганизма на тест-объектах, обработанных ДС.
7. Методы исследования и оценки спороцидной активности ДС
при использовании в качестве тест-микроорганизмов
вирулентных штаммов B. anthracis
При использовании в качестве тест-микроорганизмов спор непатогенных штаммов (B. cereus, B. subtilis, сибиреязвенная живая сухая вакцина СТИ-1 и др.) спороцидную активность ДС определяют только культуральным методом, а при использовании вирулентного штамма B. anthracis - одновременно культуральным и биологическим. При культуральном методе результаты исследований оценивают по росту тест-микроорганизмов на питательных средах до и после действия ДС, а при биологическом - по гибели белых мышей от возбудителя сибирской язвы.
Трудность соблюдения противоэпидемических мероприятий при использовании вирулентных штаммов B. anthracis не дает возможности его применения при определении эффективности обеззараживания многих объектов (воды, камерного метода обеззараживания вещей и др.), поэтому для изучения спороцидной активности и эффективности ДС при обеззараживании различных объектов рекомендуется использовать непатогенные тест-микроорганизмы.
После установления спороцидной активности ДС культуральным методом, применяя вышеуказанные непатогенные тест-микроорганизмы, целесообразно проводить исследования культуральным и биологическим методами, используя B. anthracis, т.к. биологический метод позволяет отличить спороцидное действие ДС от споростатического при отсутствии полной нейтрализации действующего вещества ДС химическими нейтрализаторами.
Спороцидная эффективность ДС с использованием спор вирулентных штаммов B. anthracis может быть изучена на следующих контаминированных тест-объектах: поверхности помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и др.; изделий медицинского назначения; предметов ухода за больными; посуды, включая столовую, лабораторную и из-под выделений; белья, одежды, спецодежды и других объектов из тканей; изделий из резины, в т.ч. перчаток, сапог, фартуков и др.; выделений (фекалий, мочи, мокроты), крови, медицинских отходов. Эти исследования проводятся при строгом соблюдении всех правил безопасности, предусмотренных СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I и II группы патогенности (опасности)" в специализированных лабораториях, имеющих разрешения на работу с вирулентными штаммами возбудителя сибирской язвы, соответствующее оборудование и подготовленный персонал.