Методика изучения спороцидной активности ДС при работе с B. anthracis.
В качестве тест-микроорганизмов используют вирулентные штаммы B. anthracis
+ +
(шт. 81/1 и 27, имеющие плазмиды рХ01 и рХ02 ), единичные клетки которых
при внутрибрюшинном введении вызывают гибель биопробных животных.
Характеристика этих штаммов, требования по устойчивости, питательные среды
для культивирования приведены в п. 4 и Прилож. 1 и 2.
Методы получения суспензии спор вирулентных штаммов B. anthracis, обеспечение стандартных условий проведения исследований спороцидной активности ДС и их субстанций, исследования спороцидной активности и эффективности при разработке режимов применения ДС для обеззараживания объектов внешней среды, контаминированных тест-микроорганизмами в споровой форме, изложены в п. п. 3.2, 4, 5, 6.
При контроле спороцидного действия ДС на споры вирулентных штаммов B. anthracis действующее вещество необходимо сразу после окончания экспозиции нейтрализовать соответствующим нейтрализатором с последующим высевом на твердые и/или жидкие питательные среды (как изложено в предыдущих разделах).
Одновременно часть пробы исследуют при постановке биопробы, используя белых мышей весом 10 - 12 г в количестве 6 штук на постановку одной биопробы. Подготовленную и использованную пробу вводят внутрибрюшинно белым мышам в объеме 0,2 мл каждой. Параллельно проводят контрольные заражения животных раствором нейтрализатора (контроль отсутствия губительного действия нейтрализатора на белых мышей) и суспензией интактных (не подвергшихся воздействию ДС) спор вирулентных штаммов B. anthracis в заражающих дозах (контроль вирулентного действия использованной суспензии спор возбудителя). Количество животных в контрольных группах должно быть не менее 3.
Наблюдения за животными проводят в течение 48 - 96 ч; павших и выживших мышей вскрывают, делают посев из органов животных на агар Хоттингера (pH 7,0) для выделения возбудителя сибирской язвы.
Посевы подготовленных проб из органов животных инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 48 - 96 ч. Идентифицируют и подсчитывают выросшие колонии B. anthracis.
Эффективным считается ДС, после воздействия которого в установленных режимах не обнаружены жизнеспособные клетки вирулентных штаммов B. anthracis при исследовании культуральным методом, и не наблюдается павших животных в опытной группе, в пробах - высев из органов животных, с которыми проводили контроль патогенного возбудителя B. anthracis.
8. Методы исследования и оценки спороцидной эффективности
СС, предназначенных для стерилизации ИМН, включая эндоскопы
8.1. Исследование спороцидной эффективности водяного
насыщенного пара под избыточным давлением,
предназначенного для стерилизации ИМН
Метод предназначен для исследования эффективности стерилизации ИМН водяным насыщенным паром под избыточным давлением, в т.ч. при испытаниях новых паровых стерилизаторов. Исследование проводят в паровых стерилизаторах при загруженной стерилизационной камере.
Для контроля эффективности стерилизации ИМН водяным насыщенным паром под избыточным давлением используют тест-объекты и тест-изделия, контаминированные суспензией спор тест-микроорганизма G. stearothermophilus, а также биологические индикаторы, разрешенные к применению в установленном порядке при паровом методе стерилизации в Российской Федерации.
В качестве тест-объектов применяют тест-образцы (0,5 х 1,0 см), нарезанные из резин, латекса, бязи, перевязочных материалов и др. Подготовленные тест-объекты стерилизуют паровым или воздушным методом (тест-объекты из резин, латекса, бязи, перевязочных материалов раскладывают в чашки Петри).
Из исходной суспензии спор G. stearothermophilus готовят суспензию,
7 8
содержащую от 5,0 х 10 до 2,5 х 10 спор в 1 мл для контаминации
тест-объектов. Стерильные тест-объекты контаминируют этой суспензией из
6
расчета (1,0 - 5,0) х 10 спор в объект путем нанесения на каждый
тест-объект с помощью дозатора пипеточного 0,02 мл исходной суспензии.
Контаминированные тест-объекты высушивают в термостате при температуре (37
+/- 1) °С в течение 24 ч и закладывают в бумажные и комбинированные
(полимерная пленка + бумага) пакеты, разрешенные к применению в качестве
стерилизационных упаковочных материалов для парового метода стерилизации в
Российской Федерации.
В качестве тест-изделий используют ИМН из коррозионно-стойких металлов
(хирургические, стоматологические, гинекологические инструменты -
корнцанги, зажимы, щипцы, пинцеты), стекла (пробирки, микропипетки), резин
(катетеры, зонды, трубки), пластмасс (наконечники, лотки), которые
предварительно стерилизуют паровым методом, а затем контаминируют исходной
суспензией спор тест-микроорганизма G. stearothermophilus (плотность
6
контаминации 10 спор на тест-изделие) и упаковывают в бумажные пакеты или
листовые материалы или бязь - при размещении изделий в коробках
стерилизационных; в комбинированные пакеты - при размещении изделий в
корзинах загрузочных.
Упаковки с контаминированными тест-объектами/тест-изделиями, а также биологическими индикаторами нумеруют и размещают вместе с максимальными термометрами в контрольные точки стерилизационной камеры вне коробок стерилизационных/корзин загрузочных у двери и задней стенки и в коробки стерилизационные/корзины загрузочные между изделиями.
Тест-объекты размещают между изделиями, применяемыми в качестве имитаторов загрузки, а также в изделиях - перчатках, халатах; тест-изделия - между изделиями, использующимися в качестве имитаторов загрузки.
Плотность загрузки коробок стерилизационных изделиями из резин и текстиля должна соответствовать нормам, приведенным в "Методических указаниях по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения" (от 30.12.98, МУ N 287-113). Указанные изделия, а также изделия из металлов и стекла в коробках стерилизационных и корзинах загрузочных распределяют равномерно; пакеты заполняют изделиями не более чем на 3/4 объема.
Стерилизатор включают и после его выхода на режим (достижение номинального значения давления/температуры стерилизации) начинают отсчет времени выдержки. По окончании времени выдержки тест-объекты и тест-изделия вынимают из стерилизатора.
Тест-объекты из резин, латекса, бязи пинцетом, который обжигают в пламени, помещают в бактериологические пробирки с 5 мл питательного бульона (бульон Хоттингера, МПБ, СПБ).
Для контроля стерильности крупных тест-изделий, подвергнутых обработке в стерилизаторе, осуществляют посев в питательный бульон марлевых салфеток (размер 5 х 5 см), с помощью которых производят отбор проб с изделий методом смыва. Салфетки предварительно увлажняют стерильным физиологическим раствором (0,9%-ный раствор натрия хлорида). У изделий, имеющих каналы, через последние пропускают физиологический раствор, после чего его засевают в питательный бульон.
Инкубирование посевов проводят при температуре (55 +/- 1) °С в течение 7 сут. при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, СПБ, МПБ).
При наличии роста микроорганизмов производят сравнение выделенной культуры с тест-микроорганизмом.
В качестве средств контроля используют тест-объекты и тест-изделия, которые не подвергают обработке в стерилизаторе. Посевы контрольных тест-объектов и тест-изделий или смывы с них в питательную среду, а также инкубирование посевов осуществляют аналогично тест-объектам/тест-изделиям, которые подвергали обработке в стерилизаторе.
Аналогичную методологию исследования применяют и при отработке эффективных режимов стерилизации ИМН во вновь разрабатываемых паровых стерилизаторах. Для этого эксперименты проводят при различном времени выдержки и размещении тест-объектов/тест-изделий и максимальных термометров в различных точках стерилизационной камеры. Для установления эффективности обработки проводят не менее трех экспериментов на (каждый режим) каждое время обработки.
Критерием эффективности водяного насыщенного пара под избыточным давлением для стерилизации ИМН является 100%-ная гибель спор G. stearothermophilus на тест-объектах и тест-изделиях (тест-объектах/тест-изделиях) из различных материалов, обработанных в исследуемом аппарате.
8.2. Исследование спороцидной эффективности сухого горячего
воздуха, предназначенного для стерилизации ИМН
Метод предназначен для исследования эффективности стерилизации ИМН сухим горячим воздухом, в т.ч. при испытаниях новых воздушных стерилизаторов.
Исследование проводят в воздушных стерилизаторах при загруженной стерилизационной камере.
Для контроля эффективности стерилизации ИМН сухим горячим воздухом в качестве тест-изделий используют пробирки типа П2-21-200, ГОСТ 25336-82 (для стерилизаторов объемом стерилизационной камеры до 20 куб. дм включительно), и чашки биологические Петри с крышками низкие ЧБН-1-100 по ГОСТ 25336-82 (для стерилизаторов объемом стерилизационной камеры 40 куб. дм и более). Предварительно их стерилизуют паровым или воздушным методом и контаминируют суспензией спор тест-микроорганизма B. licheniformis. Кроме этого, используют биологические индикаторы, разрешенные к применению в установленном порядке при воздушном методе стерилизации в РФ.
8 9
Из исходной суспензии спор готовят суспензию, содержащую от 10 до 10