│ │ 6│ │ │ │ │ │ │
│Сибиреязвенная │(1 - 5) х 10 │360 │60 │60 │- │6 - 7 │- │
│живая сухая │ │ │ │ │ │ │ │
│вакцина СТИ-1 │ │ │ │ │ │ │ │
│для людей │ │ │ │ │ │ │ │
├───────────────┼─────────────┼──────┼─────┼──────┼────────┼────────┼──────────────┤
│ │ 6│ │ │ │ │ │ │
│Bacillus │(1 - 5) х 10 │360 │60 │60 │- │6 - 7 │- │
│anthracis, │ │ │ │ │ │ │ │
│шт. 81/1 или 27│ │ │ │ │ │ │ │
├───────────────┴─────────────┴──────┴─────┴──────┴────────┴────────┴──────────────┤
│ Тест-микроорганизмы для изучения и оценки стерилизующих средств и их субстанций │
├───────────────┬─────────────┬──────┬─────┬──────┬────────┬────────┬──────────────┤
│ │ 6│ │ │ │ │ │ │
│Bacillus │(1 - 5) х 10 │360 │60 │60 │- │6 - 7 │- │
│cereus, шт. 96 │ │ │ │ │ │ │ │
├───────────────┼─────────────┼──────┼─────┼──────┼────────┼────────┼──────────────┤
│ │ 6│ │ │ │ │ │ │
│Bacillus │(1 - 5) х 10 │360 │60 │180 │- │6 - 7 │- │
│subtilis, шт. 7│ │ │ │ │ │ │ │
├───────────────┼─────────────┼──────┼─────┼──────┼────────┼────────┼──────────────┤
│ │ 6│ │ │ │ │ │ │
│Bacillus │(1 - 5) х 10 │- │- │- │30 │- │- │
│licheniformis G│ │ │ │ │ │ │ │
│BKM B-1711D │ │ │ │ │ │ │ │
├───────────────┼─────────────┼──────┼─────┼──────┼────────┼────────┼──────────────┤
│ │ 6│ │ │ │ │ │ │
│Geobacillis │(1 - 5) х 10 │- │- │- │- │- │15 │
│stearothermo- │ │ │ │ │ │ │ │
│philis, шт. │ │ │ │ │ │ │ │
│ВКМ В-718 │ │ │ │ │ │ │ │
└───────────────┴─────────────┴──────┴─────┴──────┴────────┴────────┴──────────────┘
Музейные штаммы тест-микроорганизмов хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °С в виде сухой культуры в ампулах (после лиофильной сушки) не более двух лет [13].
Тест-микроорганизмы, не обладающие указанной устойчивостью, подлежат замене.
Спороцидную активность ДС, СС и их субстанций определяют, используя тест-микроорганизмы в споровой форме [12].
Дальнейшие исследования проводят с использованием наиболее устойчивого к проверяемому ДС тест-микроорганизма.
3.2. Методика приготовления суспензии спор
тест-микроорганизмов
Для получения тест-микроорганизмов в споровой форме их выращивают на питательных средах, приведенных в табл. 2.
Таблица 2
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ
ТЕСТ-МИКРООРГАНИЗМОВ В СПОРОВОЙ ФОРМЕ
| N п/п | Тест-культуры | Питательные среды |
| 1 | Bacillus cereus, шт. 96 | Пшеничный агар |
| 2 | Bacillus subtilis, шт. 7 | |
| 3 | Bacillus anthracis, шт. 81/1, 27 | Пшеничный агар или агар Хоттингера с аминным азотом 120 мг % |
| 4 | Bacillus licheniformis, G ВКМ В-1711D | Пшеничный агар или картофельно- пептонный агар |
| 5 | Geobacillis stearothermophilis, шт. ВКМ В-718 |
Перечень компонентов и методика приготовления питательных сред для культивирования тест-микроорганизмов, предназначенных для изучения и оценки спороцидной активности ДС, СС и их субстанций, приведены в Прилож. 2.
Процесс приготовления суспензии спор тест-микроорганизма, используемого при исследовании и оценке спороцидной активности ДС, СС и их субстанций, включает три последовательных этапа:
- получение бульонной культуры из музейной лиофилизированной или агаровой культуры тест-микроорганизма;
- получение споровой агаровой культуры тест-микроорганизма;
- приготовление суспензии спор тест-микроорганизма и оценка соответствия ее требованиям.
При использовании лиофилизированной споровой культуры ампулы с этой культурой вскрывают в асептических условиях следующим образом: тампоном ваты, смоченным этиловым спиртом, обрабатывают поверхность ампулы, затем нагревают ее запаянный конец над пламенем. К накаленному концу ампулы прикладывают ватную пробку, смоченную стерильной водой, чтобы на ампуле образовалась трещина. Металлическим инструментом (скальпель, пинцет) откалывают по трещине конец ампулы. После этого стерильной пастеровской пипеткой в ампулу вливают 0,2 мл стерильной питьевой воды и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре. Для получения суспензии спор содержимое ампулы перемешивают с помощью стерильной бактериологической петли.
Полученную таким образом в ампуле суспензию спор тест-микроорганизма отсасывают стерильной пастеровской пипеткой и переносят по 1 - 2 капли в две пробирки с 5 мл питательного бульона (бульон Хоттингера, сухой питательный бульон - СПБ, мясопептонный бульон МПБ), содержащего 0,5% глюкозы.
При работе с возбудителем сибирской язвы для приготовления суспензии спор ампулы с высушенными культурами вскрывают в помещении музея (коллекции) живых культур. Манипуляции проводят в боксе биологической безопасности. При этом оттянутый конец ампулы нагревают над пламенем газовой горелки; затем влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.
После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезинфицирующий раствор. Вскрытую ампулу накрывают стерильным марлевым тампоном на 1 - 2 мин. Затем в ампулу вносят 0,2 мл стерильной питьевой воды для приготовления суспензии спор, которую далее высевают в жидкие питательные среды, как указано выше.
Посевы G. stearothermophilis инкубируют при температуре (55 +/- 1) °С, а B. cereus, B. subtilis, B. anthracis и B. licheniformis - при температуре (37 +/- 1) °С в течение 24 - 48 ч.
Бульонные культуры тест-микроорганизмов бактериологической петлей или пастеровской пипеткой (по 1 - 2 капли) пересевают в пробирки на скошенную питательную среду (сухой питательный агар - СПА, мясопептонный агар - МПА). Посевы инкубируют в течение 24 - 48 ч, как указано выше.
Для получения спор культур B. licheniformis, G. stearothermophilis в пробирки с посевом необходимого для проведения исследования тест-микроорганизма добавляют 5 мл стерильной дистиллированной воды и смывают культутру, выросшую на твердой питательной среде. Полученную взвесь переносят во флаконы или емкости до 250/500 мл, содержащие соответственно 100/200 мл соответствующей для данного тест-микроорганизма скошенной твердой (агаровой) питательной среды (табл. 2).
На поверхность питательной среды в каждый флакон (матрац) в зависимости от его вместимости (250/500 мл) вносят суспензию, смытую с 1 - 2 пробирок с посевами. Взвесь покачиванием флакона (матраца) равномерно распределяют по поверхности среды, закрывают ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками и инкубируют при температуре (55 +/- 1) °С (G. stearothermophilus) или (37 +/- 1) °С (B. licheniformis) в течение 10 - 12 сут. в наклонном положении (под углом 45 °С) агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат, работающий при температуре (55 +/- 1) °С, помещают открытые емкости с водой (до 2 л на термостат вместимостью 80 л).
Тест-микроорганизмы B. cereus, B. subtilis и B. anthracis для получения споровой формы засевают на скошенный пшеничный агар или агар Хоттингера с аминным азотом 120 мг % и выращивают при температуре (37 +/- 1) °С двое суток в термостате, а затем еще 7 - 12 суток при температуре (20 +/- 1) °С в темном месте. На 7 и 9 сут. культуры проверяют на интенсивность спорообразования. Для этого выборочно из 2 - 3 флаконов (матрацев) культуру забирают петлей с верхнего, среднего и нижнего участков агара; все три пробы растирают вместе на одном предметном стекле, распределяя тонким слоем. Мазок фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму или генцианвиолетом (по Синеву). Окрашенные препараты промывают питьевой водой, подсушивают и микроскопируют с иммерсионной системой - споры имеют вид неокрашенных пустот, находящихся внутри клеток.