При работе с B. anthracis для фиксации мазков используют 90°-ный этиловый спирт или смесь Никифорова (равное количество спирта и эфира), время фиксации 30 мин. Затем мазок окрашивают при нагревании 1 - 2 мин. карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая в 2%-ный раствор азотной кислоты в спирте или в 1%-ный раствор серной кислоты, так чтобы на препарате не было видно следов красителя. После этого мазок промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего. Допустима окраска по Ожешко. При окраске B. anthracis карболовым фуксином споры окрашиваются в красный цвет.
Исследуют 10 полей зрения, подсчитывают количество спор, выражая в процентах. Достаточным количеством считают не менее 90% спор в поле зрения от общего числа клеток.
После завершения спорообразования культуру осторожно при помощи шпателя (из проволоки) или стерильных стеклянных бус смывают с поверхности агара 5 - 10 мл стерильной дистиллированной воды (в зависимости от вместимости флакона) и сливают в емкости (пробирки, флаконы), которые закрывают стерильными резиновыми пробками.
Для оценки качества полученной споровой суспензии тест-микроорганизма и принятия решения о возможности использования ее по назначению из флакона (после тщательного перемешивания путем встряхивания) стерильно отбирают в пробирку 10 мл суспензии и определяют соответствие требованиям по биологической концентрации (БК) спор в суспензии и их устойчивости к эталонным физическим и химическим агентам, представленным в табл. 1.
3.3. Определение биологической концентрации
тест-микроорганизма в споровой суспензии
Определение выполняют методом последовательных десятикратных разведений суспензии тест-микроорганизма в стерильной дистиллированной воде с последующим высевом суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (агар Хоттингера, СПА, МПА). После определенного времени инкубации при соответствующей температуре проводят подсчет выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) и определяют количество жизнеспособных спор в одном мл суспензии.
Для проведения испытания необходимы материалы и оборудование, приведенные в Прилож. 3.
При выполнении испытания соблюдают следующие условия:
- используют дозаторы пипеточные не менее 2-го класса точности;
- в процессе выполнения опыта соблюдают асептические условия;
- контролируют температуру термостата и срок инкубации посевов.
До проведения испытания выполняют следующие подготовительные операции:
- расплавляют на кипящей водной бане плотную питательную среду (агар) и охлаждают ее до температуры (45 +/- 5) °С;
- охлажденную питательную среду разливают по (25 +/- 5) куб. см в стерильные чашки Петри в пламени спиртовки (газовой горелки) и оставляют чашки на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар;
- при необходимости подсушивают чашки с плотной питательной средой в термостате крышками вниз;
- разливают в стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками по 4,5 куб. см стерильной дистиллированной воды.
В работе используют только кондиционные партии питательных сред, для чего предварительно проверяют их качество путем высева эталонной культуры соответствующего штамма. Для кондиционной среды число выросших тест-микроорганизмов от их общего количества должно составлять не менее 50%.
При определении БК тест-микроорганизма в исходной суспензии спор
агаровой культуры последнюю разводят стерильной дистиллированной водой до
концентрации, соответствующей по бактериальному стандарту мутности 1 млрд.
микробных тел в 1 мл. Затем стерильной пипеткой отбирают 0,5 мл суспензии
спор и переносят в пробирку, содержащую 4,5 мл стерильной дистиллированной
-1
воды. Полученное разведение (10 ) тщательно встряхивают. Аналогично, меняя
-6
пипетку, делают все последующие разведения до необходимого (10 ),
3
теоретически соответствующего концентрации 1 х 10 спор в 1 мл. Из двух
последовательных десятикратных разведений исходной суспензии производят
высев по 0,1 мл на поверхность трех чашек Петри с агаром (агар Хоттингера,
СПА, МПА). Чашки Петри инкубируют при температуре (55 +/- 1) °С или (37 +/-
1) °С в зависимости от вида культуры в течение 24 - 48 ч, после чего
определяют число КОЕ. Количество жизнеспособных спор в исходной суспензии
определяют как среднее арифметическое число КОЕ с учетом разведения
исходной суспензии и объема пробы для посева.
Пример расчетов. Предположим, что при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1:100000 подсчитано 140, 110 и 134 КОЕ. Аналогичные высевы из разведений 1:1000000 привели к образованию 12, 14 и 16 КОЕ.
Вычисляем общее число КОЕ, найденное во всех трех чашках Петри соответствующих разведений:
1:100000 140 + 110 + 134 = 38,4;
1:1000000 12 + 14 + 16 = 42.
Среднее число КОЕ на чашках составит для разведения:
1:100000 384 : 3 = 128;
1: 1000000 42 : 3 = 14.
Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем число жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведений, далее находим среднее арифметическое числа КОЕ:
5 7
128 х 10 х 10 = 12,8 х 10 ;
6 7
14 х 10 х 10 = 14,0 х 10 .
Таким образом, число жизнеспособных спор в исходной суспензии составит:
7 7 8
(12,8 + 14,0) х 10 : 2 = 13,4 х 10 = 1,32 х 10 спор/мл.
Или при посеве из одного последнего разведения по 0,1 мл на 5 чашек Петри расчет концентрации жизнеспособных микроорганизмов в 1 мл суспензии препарата осуществляют по формуле:
БК = х р 2,
где:
БК - концентрация жизнеспособных спор тест-микроорганизма, КОЕ мл;
х - суммарное количество колоний, выросших на пяти чашках, КОЕ;
р - разведения;
2 - коэффициент, приводящий измерение объема посеянной суспензии к 1 мл.
Например: общее количество колоний на 5 чашках Петри составило 540 КОЕ, тогда количество жизнеспособных спор в исходной суспензии равно:
6 6 9
БК = 540 х 2 х 10 = 1080 х 10 = 1,08 х 10 спор/мл.
Герметично закрытые стерильной пробкой флаконы (пробирки) с исходной суспензией спор хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °С до 6 мес., если споры тест-микроорганизма соответствуют вышеуказанным требованиям (табл. 1). Для снижения негативного влияния на суспензию спор перепада температуры, неизбежного при извлечении флакона из холодильника для отбора части суспензии, необходимой для проведения исследования ДС, СС и их субстанций, суспензию спор тест-микроорганизма из флакона целесообразно расфасовывать в пробирки и использовать их по мере необходимости.
Чистоту культуры тест-микроорганизма на всех этапах культивирования контролируют путем посева ее на чашки Петри с агаром Хоттингера, СПА, МПА.
Сибиреязвенную живую сухую вакцину (СТИ-1) при изучении спороцидной
3
активности и эффективности используют в виде суспензии, содержащей 10 -
9
10 спор/мл, приготовленной разбавлением содержимого одной ампулы в 10 мл
стерильной питьевой воды.
3.4. Методики определения устойчивости спор
тест-микроорганизмов к эталонным ДС
3.4.1. Определение устойчивости спор к текучему пару,
водяному насыщенному пару под избыточным давлением,
сухому горячему воздуху
Устойчивость к действию текучего пара спор B. cereus, B. subtilis, B. anthracis, сибиреязвенной вакцины СТИ-1 определяют в аппарате Ойль-Мюллера, используя батистовые тест-объекты, контаминированные вышеуказанными тест-микроорганизмами, с последующим посевом тест-объектов в жидкую питательную среду.
Аппарат Ойль-Мюллера может быть заменен устройством, доступным для изготовления практически в любой лаборатории, где необходимо провести такое исследование. Для этого берется стеклянная колба объемом 1 - 2 л с широким удлиненным горлом. Корковую пробку под него срезают на 1/3 по длине для обеспечения выхода пара. Это отверстие используется и для проведения измерения термометром температуры пара в месте размещения батистовых тест-объектов. Через трубку пропускают проволоку, имеющую на конце припаянную (или укрепленную другим способом) перпендикулярно к ней металлическую сеточку диаметром 3 - 3,5 см из нержавеющей стали, предназначенную для размещения батистовых тест-объектов, контаминированных спорами тест-микроорганизма.
Проволоку в пробке устанавливают так, чтобы сеточка находилась в месте перехода конуса колбы в горло. Это обеспечивает прохождение через сеточку практически всего объема выделяемого кипящей в колбе водой пара. Уровень воды должен находиться от сеточки на расстоянии 5 - 6 см.
В процессе испытаний контролируют следующие показатели:
- температуру текучего пара;
- исходную и остаточную контаминацию батистовых тест-объектов;
- время действия пара на контаминированные тест-объекты в аппарате Ойль-Мюллера (колбе).
Исследования проводят следующим образом: в колбу наливают дистиллированную воду и нагревают ее до кипения. При достижении температуры 100 °С на термометре, находящемся под воздействием текучего пара, на предварительно простерилизованную автоклавированием вместе с пробкой или обожженную в пламени сеточку помещают 2 батистовых тест-объекта (1 х 0,5 см), контаминированных спорами тест-микроорганизма (методику приготовления тест-объектов см. в п. 5.2). Тест-объекты размещают так, чтобы исключался контакт их со стенкой горла колбы при введении сеточки в колбу. Держась за пробку, сеточку с тест-объектами вносят в зону действия текучего пара и включают секундомер. По истечении 2 мин. воздействия пара, держась за пробку, сеточку с тест-объектами извлекают из колбы, а тест-объекты сразу помещают (засевают) в две пробирки со стерильным питательным бульоном. Обжигают сеточку и кладут на нее 2 новых тест-объекта. Аналогично вышеописанному вносят их в зону действия пара на 2 мин., затем также извлекают и помещают в пробирки со стерильным питательным бульоном. Так операцию повторяют, увеличивая экспозицию на 1 мин. до 10 мин. Посевы инкубируют при (37 +/-1) °С в течение 7 сут. Предварительный учет результатов проводят через 48 ч инкубирования, окончательный - на 7 сут. Из проросших пробирок с бульоном делают посев петлей на твердую среду для идентификации выросших тест-микроорганизмов.