При использовании аппарата Ойль-Мюллера необходимо не допускать случайного прикосновения к горлышку колбы сначала до обеззараживания тест-объектов, затем - после обеззараживания. Этих погрешностей, искажающих результаты опыта, можно избежать при использовании аппарата Ойль-Мюллера в модификации Л.А. Блиновой (рис. 1 - не приводится). В емкости для текучего пара имеются четыре отверстия. Первое отверстие (1) размещается вверху и предназначено для термометра, второе (2) справа в торце - для внесения зараженных тест-объектов, третье (3) - на лицевой стороне - для изъятия обеззараженных тест-объектов и четвертое (4) - слева в торце для выхода пара. При пользовании таким аппаратом тест-объекты накалывают на иглу, закрепленную в пробке, которую вставляют в отверстие 2. Отверстие 3 во время экспозиции закрыто стерильной пробкой. По окончании экспозиции его открывают и через него извлекают обожженным пинцетом снятые с иглы тест-объекты, которые сразу засевают в бульон.
Применяемый в аппарате термометр должен иметь шкалу с делениями на десятые доли градуса. Определение устойчивости спор бацилл к текучему пару проводят при атмосферном давлении, близком к 760 мм рт. ст. Учет этого фактора важен, поскольку существенно может влиять на результаты оценки. Так, при атмосферном давлении 745 мм рт. ст. температура текучего пара составляет 99,4 °С, и резистентность при этой температуре B. cereus равна 6 - 7 мин., а при давлении 765 мм рт. ст. температура пара - 100,8 °С, резистентность не превышает 3 - 4 мин.
Споры тест-микроорганизмов должны иметь устойчивость к текучему пару температурой 100 °С не менее 7 - 9 мин.
Устойчивость тест-микроорганизма G. stearothermophilus к водяному насыщенному пару под избыточным давлением.
В качестве тест-носителя применяют флаконы из нейтрального стекла, контаминированные суспензией спор тест-микроорганизма G. stearothermophilus.
Предварительно флаконы тщательно моют и стерилизуют паровым или воздушным методом. Из исходной суспензии спор готовят рабочую суспензию для контаминации тест-носителей.
6
Стерильные тест-носители контаминируют из расчета (1 - 5) х 10
тест-микроорганизма G. stearothermophilus, что достигается внесением в
каждый носитель с помощью дозатора пипеточного 0,02 мл суспензии спор с
7 8
содержанием от 5 х 10 до 2,5 х 10 спор/мл.
Контаминированные тест-носители высушивают в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 24 ч и закладывают в бумажные пакеты, разрешенные к применению в качестве стерилизационных упаковочных материалов в Российской Федерации.
Устойчивость спор тест-микроорганизма G. stearothermophilus к водяному насыщенному пару под избыточным давлением определяют в паровом стерилизаторе объемом 75 куб. дм с гравитационным способом предварительного удаления воздуха из стерилизационной камеры.
Упакованные тест-носители помещают в стерилизационной коробке в незагруженную камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере (1,1 +/- 0,1) кгс/кв. см проводят вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора (продувка парового стерилизатора) в течение 10 мин. (при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от 0,1 до 0,2 кгс/кв. см). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до 1,1 +/- 0,1 кгс/кв. см при температуре (121 +/- 1) °С и через 5 мин. (время выживания спор тест-микроорганизма) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после периода испытуемого воздействия (время воздействия при температуре (121 +/- 1) °С) подъем давления проводят максимум в течение 8 мин., спуск - в течение 3 мин. Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами (СП-82).
Аналогичное исследование проводят с 15-минутным временем воздействия (время гибели спор тест-микроорганизма). При каждом из указанных периодов воздействия экспонируют не менее 10 тест-носителей. По окончании времени выдержки тест-носители вынимают из стерилизатора. Во флаконы вносят 1 мл питательной среды (бульон Хоттингера, МПБ, СПБ, цветная питательная среда с индикатором бромкрезоловым пурпуровым), закрывают стерильными резиновыми пробками (N 7,5) и инкубируют при температуре (55 +/- 1) °С в течение 7 сут. при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, СПБ, МПБ) или в течение 48 ч при использовании цветной питательной среды с индикатором бромкрезоловым пурпуровым.
Учет результатов проводят путем визуального осмотра. Отсутствие помутнения/изменения цвета питательной среды с индикатором указывает на гибель спор. При наличии роста микроорганизмов проводят сравнение последних с тест-микроорганизмом.
В качестве контроля используют тест-носители, которые не подвергали действию стерилизующего средства. Посевы контрольных тест-носителей и питательную среду, а также инкубирование посевов осуществляют аналогично опытным тест-носителям, которые подвергали действию стерилизующего средства.
Время гибели спор G. stearothermophilus при действии водяного насыщенного пара под избыточным давлением (1,1 +/- 0,1) кгс/кв. см, температуре (121 +/- 1) °С должно быть не менее 15 мин.
Устойчивость спор B. licheniformis к сухому горячему воздуху определяют в воздушном стерилизаторе объемом 80 куб. дм с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха более 1 м/с, которые обеспечивают допустимые предельные отклонения от номинального значения температуры.
В качестве тест-носителя применяют флаконы из нейтрального стекла,
контаминированные спорами тест-микроорганизма B. licheniformis.
Предварительно флаконы тщательно моют и стерилизуют паровым или воздушным
методом. Из исходной суспензии спор готовят рабочую суспензию для
6
контаминации тест-носителей из расчета (1 - 5) х 10 спор в носителе.
Стерильные тест-носители контаминируют рабочей суспензией спор
тест-микроорганизма B. licheniformis, что достигается внесением в каждый
тест-носитель с помощью дозатора пипеточного 0,02 мл суспензии спор в
7 8
дистиллированной воде с содержанием от 5,0 х 10 до 2,5 х 10 спор/мл.
Контаминированные тест-носители высушивают в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 24 ч и закладывают в бумажные или полимерные пакеты, разрешенные к применению в качестве стерилизационных упаковочных материалов в Российской Федерации.
Упакованные тест-носители помещают на полку воздушного стерилизатора, предварительно прогретого до 140 °С. Стерилизатор закрывают и после достижения температуры (160 +/- 3) °С начинают отсчет времени выдержки. Через 4 мин. (время выживания спор тест-микроорганизма) аппарат отключают. Контроль температуры осуществляют по наружному термометру.
Аналогичное исследование проводят с 30-минутным временем испытуемого воздействия (время гибели спор тест-микроорганизма). При каждом из указанных периодов испытуемого воздействия экспонируют не менее 10 тест-носителей.
По окончании времени выдержки тест-носители вынимают из стерилизатора. Во флаконы вносят 1 мл питательной среды (бульон Хоттингера, МПБ, СПБ, цветная питательная среда с индикатором бромтимоловым синим) и закрывают стерильными резиновыми пробками (N 7,5) и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 7 сут. при использовании питательного бульона (бульон Хоттингера, СПБ, МПБ) или в течение 48 ч при использовании цветной питательной среды с индикатором бромтимоловым синим.
Учет результатов опытов и контроля проводят так же, как при определении устойчивости спор к водяному насыщенному пару под давлением.
Время гибели спор тест-микроорганизма B. licheniformis при действии сухого горячего воздуха при температуре (160 +/- 3) °С должно быть не менее 30 мин.
3.4.2. Определение устойчивости спор к хлорамину,
перекиси водорода, глутаровому альдегиду
Устойчивость к хлорамину, перекиси водорода, глутаровому альдегиду у спор B. cereus, B. subtilis, B. anthracis, живой сухой сибиреязвенной вакцины СТИ-1 определяют методом погружения батистовых тест-объектов, контаминированных споровой суспензией указанных культур (п. 6.2), в 10%-ный раствор хлорамина, 6%-ный раствор перекиси водорода, 2,5%-ный раствор глутарового альдегида с последующей нейтрализацией действующих веществ и посевом в жидкую питательную среду.
В процессе испытаний контролируют концентрацию действующего вещества в рабочем растворе ДС, температуру его в опыте, исходный и остаточный уровень контаминации спорами тест-объекта КОЕ, время выдержки тест-объектов в испытуемом дезинфицирующем растворе.
Определение устойчивости спор к хлорамину. Йодометрическим методом определяют процент активного хлора в хлорамине. В опытах используют препарат, содержащий 26 - 28% активного хлора, растворяя который в воде готовят 10%-ный (по препарату) рабочий раствор. Готовят и разливают в пробирки по 5 мл стерильный раствор нейтрализатора (2%-ный раствор тиосульфата натрия), стерильную питьевую воду, питательный бульон (МПБ). Готовят и контаминируют тест-микроорганизмом батистовые тест-объекты (п. 5.2). Если в опытах используют ранее приготовленные и хранящиеся в холодильнике контаминированные спорами тест-микроорганизма тест-объекты, то их заранее извлекают из холодильника, чтобы они приобрели комнатную температуру (18 - 20 °С).
При проведении экспериментов в стеклянную емкость объемом 50 - 100 мл пипеткой наливают требуемый объем 10%-го раствора хлорамина из расчета 0,5 мл на каждый тест-объект и помещают в водяную баню с температурой 20 °С на весь период опыта. Отсчитывают в чашке Петри необходимое для опыта количество контаминированных спорами тест-микроорганизмов батистовых тест-объектов (по 2 на каждую экспозицию), захватывают их стерильным пинцетом все сразу и опускают в емкость с раствором хлорамина; легким покачиванием емкости добиваются полного их смачивания. В момент смачивания всех тест-объектов отмечают время.