Через каждый час стерильной петлей извлекают по 2 тест-объекта из раствора хлорамина и опускают их в пробирку с 5 мл 2%-го стерильного раствора тиосульфата натрия для нейтрализации остаточного действия хлорамина. Через 5 - 10 мин. тест-объекты переносят во вторую пробирку с 5 мл стерильной питьевой воды, а через 10 - 15 мин. каждый тест-объект помещают в 5 мл питательного бульона.
Для контроля два контаминированных спорами тест-микроорганизма тест-объекта погружают в стерильную воду (вместо раствора хлорамина) на максимальный срок экспозиции, затем (как и опытные тест-объекты) их переносят последовательно в раствор нейтрализатора (тиосульфат натрия), стерильную питьевую воду и сеют в жидкий питательный бульон в пробирках. Полноту нейтрализации активного хлора контролируют путем погружения неконтаминированных тест-объектов в раствор 10%-го хлорамина на максимальную экспозицию, затем в раствор тиосульфата натрия, промывают в воде и помещают в бульон, куда вносят 0,1 мл суспензии, содержащей 20 - 30 жизнеспособных спор тест-микроорганизма. Рост культуры в бульоне свидетельствует об эффективной нейтрализации действия хлорамина.
Посевы опытные и контрольные ставят в термостат при температуре (37 +/- 1) °С; наличие роста тест-микроорганизма проверяют через 48 ч. Из пробирок с ростом делают посев петлей на твердую питательную среду для идентификации тест-микроорганизмов. Окончательный учет результатов проводят через 7 сут.
Опыт повторяют не менее 3 раз. Споры тест-микроорганизмов B. cereus (шт. 96), B. subtilis (шт. 7), B. anthracis (шт. 81/1 и 27), живой сибиреязвенной вакцины СТИ-1 должны быть устойчивы к 10%-му раствору хлорамина не менее 360 мин.
Определение устойчивости спор к перекиси водорода. Йодометрическим методом определяют концентрацию перекиси водорода в средстве "Перекись водорода медицинская". В опытах используют средство, содержащее не менее 30% перекиси водорода, из которого путем разведения стерильной питьевой водой готовят раствор для исследований, содержащий 6% перекиси водорода. Для нейтрализации перекиси водорода используют стерильный 2,5%-ный раствор тиосульфата натрия. Подготовку и определение устойчивости спор тест-микроорганизмов к 6%-му раствору перекиси водорода проводят по такой же методике, как и к хлорамину, только в качестве нейтрализатора используют 2,5%-ный раствор тиосульфата натрия. Учитывая, что споры тест-микроорганизмов должны быть устойчивы к воздействию 6%-го раствора перекиси водорода в течение не менее 60 мин., испытание осуществляют в течение 90 мин. с отбором проб (по 2 теста) через каждые 15 мин. (обычно берут по 2 тест-объекта на 6 экспозиций). Аналогично, как и при определении устойчивости спор к хлорамину, проводят посевы, учет результатов и контроль.
Споры тест-микроорганизмов B. cereus (шт. 96), B. subtilis (шт. 7), В. anthracis (шт. 81/1 и 27), живой сибиреязвенной вакцины СТИ-1 должны быть устойчивы к 6%-му раствору перекиси водорода не менее 60 мин.
Определение устойчивости спор B. subtilis (шт. 7) к 2,5%-му раствору глутарового альдегида. Определяют концентрацию глутарового альдегида в исходном (концентрированном) растворе глутарового альдегида. В экспериментах используют средство, содержащее не менее 20% глутарового альдегида. Раствор для исследований, содержащий 2,5% глутарового альдегида, готовят путем разведения исходного раствора стерильной питьевой водой с последующим доведением pH приготовленного раствора до значения 7,5. Подготовку и определение устойчивости спор B. subtilis (шт. 7) к 2,5%-му раствору глутарового альдегида проводят по такой же методике, как и к хлорамину, используя батистовые тест-объекты, контаминированные этим тест-микроорганизмом, только в качестве нейтрализатора используют или стерильный 1%-ный раствор бисульфита натрия, или стерильный универсальный нейтрализатор, содержащий Твин-80 (3%), сапонин (0,1%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%). Учитывая, что споры некоторых тест-микроорганизмов должны быть устойчивы к воздействию 2,5%-го раствора глутарового альдегида не менее чем в течение 3 ч, испытание осуществляют в течение 6 ч с отбором проб (по 2 тест-объекта) через каждые 30 мин. Посевы, учет результатов и постановку контроля осуществляют аналогично определению устойчивости спор к хлорамину.
Споры тест-микроорганизма B. subtilis (шт. 7) должны быть устойчивы к 2,5%-му раствору глутарового альдегида не менее 3 ч.
4. Обеспечение стандартности условий проведения исследований
спороцидной активности ДС, СС и их субстанций
Химико-аналитический контроль ДС, СС и их субстанций. До проведения исследования спороцидной активности ДС, СС и их субстанций необходимо проанализировать представленные производителем утвержденные рецептуры средства и технические условия на отечественные или спецификацию на зарубежные средства, провести химико-аналитические исследования по определению концентрации действующих веществ и определить соответствие ее и других показателей, регламентированных вышеуказанными документами. При этом используют химико-аналитические методы контроля и применяют условия хранения средства и меры безопасности при работе с ним, предложенные производителем средства.
Выбор, приготовление и контроль эффективности нейтрализаторов ДС с целью исключения остаточного спороцидного или споростатического действия ДС, СС и их субстанций на тест-микроорганизмы. Для дезинфекции и стерилизации применяют средства, обладающие спороцидным действием, т.е. убивающие споры, но не задерживающие только их рост. Поэтому при определении спороцидного действия необходимо разграничить спороцидное действие средства от споростатического.
На основании накопленного опыта для нейтрализации антимикробного действия ДВ из различных химических групп (в зависимости от концентрации ДВ в растворе) применяют следующие нейтрализаторы:
- для средств из группы окислителей (хлор-, йод-, перекисьсодержащие средства; средства, содержащие надуксусную кислоту, озон) - 0,5 - 2,5%-ные растворы тиосульфата натрия;
- для альдегид- и фенолсодержащих средств - универсальный нейтрализатор, содержащий 3% полисорбита 80% (Твин-80), 3% сапонина, 0,1% гистидина и 0,1% цистеина или 3% полисорбита 80%, 2% гистидина, 0,3% лецетина, 3% сапонина;
- для катионных поверхностно-активных веществ - 1,0%-ный раствор сульфонала или 0,5 - 1,0%-ные растворы сульфонола с 10%-ным обезжиренным молоком;
- для композиционных ДС - универсальный нейтрализатор, например, содержащий 3% полисорбита 80%, 3% сапонина, 0,1% гистидина и 0,1% цистеина или 3% полисорбита 80%, 3% сапонина, 0,3% лецетина и 0,15% цистеина, 0,15% тиосульфата натрия или другие нейтрализаторы, рекомендуемые производителями.
Растворы нейтрализаторов готовят в асептических условиях, применяя только стерильную дистиллированную воду. При невозможности соблюдения асептических условий приготовления нейтрализаторов допускается стерилизация готовых растворов автоклавированием при 1,1 кгс/кв. см (121 °С) в течение 15 мин. Температура растворов нейтрализаторов должна быть 20 °С независимо от температуры окружающей среды. Готовые растворы необходимо использовать в день приготовления. Допускается хранение готовых растворов при температуре 4 °С в течение 48 ч.
Контроль полноты нейтрализации остаточного действия испытываемого средства. Существующие рекомендации по применению нейтрализаторов рассчитаны для различных монодействующих веществ (ДВ). Однако многие современные ДС содержат несколько ДВ и другие вспомогательные вещества, которые могут обладать споростатическим действием. Поэтому существующие (рекомендуемые) нейтрализаторы могут не обеспечивать эффективную нейтрализацию остаточного действия таких ДС. В этой связи результаты оценки эффективности ДС могут быть необъективными. Поэтому каждый случай проведения испытаний, даже известного ДС, должен предварительно сопровождаться экспериментальным контролем эффективности нейтрализации остаточного действия ДС на тест-микроорганизм.
Для контроля эффективности нейтрализатора и полноты нейтрализации остаточного действия ДС используют суспензионный метод как обеспечивающий наиболее жесткие условия действия нейтрализатора при проведении испытаний ДС. Последовательность и методология выполнения основных операций при проведении такого эксперимента и их назначение приведены на схеме рис. 2 и в табл. 3.
Рабочий Стерильный Стерильная
раствор ДС нейтрализатор дистиллированная вода
┌─────────┴────────┐ │ │
│ по 1 мл │ │ по 1 мл │
\/ \/ \/ \/
Пробирка N 1 Пробирка N 2 Пробирка N 3 Пробирка N 4
9 мл суспензии 9 мл суспензии 9 мл суспензии 9 мл суспензии
спор на дистили- спор на спор на спор на дистили-
рованной воде нейтролизаторе нейтролизаторе рованной воде
3 3 3 3
(1 х 10 спор/мл) (1 х 10 спор/мл) (1 х 10 спор/мл) (1 х 10 спор/мл)
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
\/ \/ \/ \/ \/ \/ \/ \/ \/ \/ \/ \/
Высев из каждой пробирки по 0,1 мл на чашки Петри
с соответствующей для тест-микроорганизма плотной питательной
средой (не менее 3 на пробу)
Рис. 2. Принципиальная схема проведения эксперимента
по контролю эффективности нейтрализации действия ДС на споры
тест-микроорганизма используемым нейтрализатором
Таблица 3
НАЗНАЧЕНИЕ ОПЕРАЦИЙ ЭКСПЕРИМЕНТА ПО ОЦЕНКЕ
ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ОСТАТОЧНОГО ДЕЙСТВИЯ ДС
┌─────┬────────────────┬───────────────────────────────────┬──────────────┐
│ N │ Назначение │ Процедура выполнения операции │ Ожидаемый │