│пробы│ операции │ исследования │ результат │
│ │ исследования │ │ │
├─────┼────────────────┼───────────────────────────────────┼──────────────┤
│ │ │ 3 │ │
│1 │Контроль │К 9 мл суспензии спор (10 спор/мл)│Рост микро- │
│ │губительного │на дистиллированной воде + 1 мл │организмов │
│ │действия ДС │раствора ДС (перемешать │должен │
│ │ │встряхиванием пробирки) │отсутствовать │
├─────┼────────────────┼───────────────────────────────────┼──────────────┤
│ │ │ 3 │ │
│2 │Контроль │К 9 мл суспензии спор (10 спор/мл)│Примерно оди- │
│ │полноты │с нейтрализатором + 1 мл раствора │наковое (или в│
│ │нейтрализации │ДС (сразу интенсивно перемешать │пределах │
│ │ДС │встряхиванием пробирки) │ошибки в 25%) │
├─────┼────────────────┼───────────────────────────────────┤КОЕ в посевах │
│ │ │ 3 │проб (по 0,1 │
│3 │Контроль отсут- │К 9 мл суспензии спор (10 спор/мл)│мл) на плотной│
│ │ствия антимик- │с нейтрализатором + 1 мл раствора │питательной │
│ │робного эффекта │нейтрализатора (перемешать │среде │
│ │у нейтрализатора│встряхиванием пробирки) │ │
├─────┼────────────────┼───────────────────────────────────┼──────────────┤
│ │ │ 3 │ │
│4 │Референс-кон- │К 9 мл суспензии спор (10 спор/мл)│ │
│ │троль количества│на дистиллированной воде + 1 мл │ │
│ │спор тест-микро-│дистиллированной воды (перемешать │ │
│ │организма │встряхиванием пробирки) │ │
├─────┴────────────────┴───────────────────────────────────┴──────────────┤
│ Примечание. Спустя 5 мин. после постановки опыта из каждой из четырех│
│проб производят посев смеси по 0,1 мл как минимум на 3 чашки Петри с │
│питательной средой, которые инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °С и │
│через 2 - 4 сут. учитывают результаты исследований. │
└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
Обеспечение техники безопасности при исследовании спороцидной активности ДС, СС и их субстанций. Споры тест-микроорганизмов обладают высокой устойчивостью, поэтому их гибель обеспечивают в большинстве случаев высокие концентрации ДС, СС и их субстанций и по препарату, и по ДВ. Поэтому при хранении, взвешивании, приготовлении рабочих растворов, их химико-аналитических исследованиях и проведении экспериментов необходимо применять меры защиты, предусмотренные в технических условиях на отечественные средства или спецификациях - на зарубежные, с учетом класса опасности.
КонсультантПлюс: примечание.
В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: имеются в виду Санитарные правила СП 1.2.731-99, а не СП 1.3.000-06.
Все тест-микроорганизмы, кроме патогенных штаммов возбудителя сибирской язвы, относятся к III - IV классу опасности (патогенности), поэтому микробиологические исследования с ними следует проводить в асептических условиях при соблюдении правил техники безопасности, предусмотренных СП 1.3.000-06 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами" [9].
Лабораторные исследования с использованием патогенных штаммов возбудителя сибирской язвы должны проводить специалисты, прошедшие подготовку на курсах по особо опасным инфекциям, в лицензированных лабораториях, имеющих допуск на работу с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности), при строгом соблюдении всех правил техники безопасности, предусмотренных СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности" [8].
5. Методы исследований и оценки результатов спороцидной
активности ДС, СС и их субстанций in vitro
5.1. Суспензионный метод
Суспензионный метод оценки спороцидной активности ДС и их субстанций используют для получения первичной информации о концентрации и времени эффективного (отсутствие жизнеспособных спор) спороцидного действия ДС. Методология выполнения эксперимента по оценке спороцидной активности ДС суспензионным методом приведена на схеме рис. 3.
┌──────────────────────────┐ ┌───────────────────────┐ ┌─────────────────────┐ ┌───────────────────┐
│ Приготовление суспензии │ │Приготовление рабочего │ │ Отбор из смеси 3-х │ │ <...> │
│спор тест-микроорганизмами│ │раствора ДС. Смешивание│ │проб (по 1 мл) после │ │ проб. Посев из │
│ и контроль биологической │ │ суспензии спор и │ │ каждой экспозиции и │ │каждой пробы по 0,1│
│ концентрации спор в ней ├─>│ дезинфицирующего ├─>│перенос их в пробирки├─>│ мл на чашки с │
│ путем последовательного │ │раствора в соотношении │ │с 9 мл нейтрализатора│ │питательной средой.│
│ 10-кратного разведения и │ │ 1:9. Отчет экспозиции │ │остаточного действия │ │ Термостатирование │
│ посева на плотную │ │ воздействия ДС на │ │ ДС │ │ посевов │
│ питательную среду │ │ споры │ └─────────────────────┘ └───────────────────┘
└──────────────────────────┘ └───────────────────────┘
┌───────────────────────────────────────────────────────┐
│ \/
┌────────┴─────────┐ ┌────────────────────┐ ┌───────────┐ ┌──────────┐ ┌───────────────┐ ┌─────────────┐
│Пробирка с рабочей│ │Пробирки со стериль-│ │Чашки Петри│ │ Пробирка │ │Пробирки с 9 мл│ │ Чашки Петри │
│ суспензией спор │ │ной водопроводной ├─>│ с плотной │ │или флакон│ │нейтрализатора ├─>│ с плотной │
│ тест-микроба в ├─>│водой (по 9 мл) в ├─>│питательной│ │с рабочим ├─>│(не менее 3 на ├─>│ питательной │
│ концентрации │ │количестве, ├─>│ средой (5 │ │ раствором│ │ каждую ├─>│ средой (не │
│ 9 │ │необходимом для ├─>│ чашек на │ │ ДС │ │ экспозицию) │ │ менее 3 на │
│ (2 х 10 спор/мл)│ │определения БК тест-├─>│ пробу) │ └──────────┘ └───────────────┘ │каждую пробу)│
└──────────────────┘ │микроба в суспензии │ └───────────┘ └─────────────┘
└────────────────────┘
Рис. 3. Схема алгоритма проведения эксперимента
по оценке спороцидной активности ДС суспензионным методом
Как видно из схемы рис. 3, для проведения опыта по оценке спороцидной активности ДС суспензионным методом необходимо приготовить:
- рабочую суспензию тест-микроорганизма с концентрацией спор не менее 1
9
х 10 КОЕ/мл (это обеспечивает возможность создания в смеси ДС с суспензией
(обоснованной и применяемой для этого метода оценки ДС) концентрации спор
8
порядка 1 х 10 КОЕ/мл);
- пробирки со стерильной питьевой водой для проведения контроля реальной биологической концентрации (БК) тест-микроорганизма в суспензии, используемой в опыте;
- пробирки или флакон с раствором ДС в испытываемой концентрации в количестве, необходимом для обеспечения отбора всех проб;