- необходимое количество пробирок (в зависимости от количества проб, отбираемых для определения времени, обеспечивающего полную гибель спор тест-микроорганизма), содержащих по 9 мл нейтрализатора, проверенного предварительно на эффективность нейтрализации остаточного действия испытываемого ДС на тест-микроорганизм (п. 4);
- чашки Петри со стерильной плотной питательной средой в количестве, необходимом для посева пробы контроля исходной суспензии и проб контроля эффективности действия ДС на тест-микроорганизм.
Методика проведения самого опыта включает, как видно из схемы, последовательное выполнение следующих операций:
- тщательное перемешивание хранимой в пробирке или во флаконе рабочей суспензии тест-микроорганизма путем встряхивания в течение 2 - 3 мин.;
- помещение испытываемого рабочего раствора ДС в водяную баню с заданной температурой; если задачей эксперимента не предусмотрено изучение влияния воздействия температуры на эффективность средства, то оценка эффективности раствора испытываемого средства осуществляется при температуре 18 - 20 °С;
- проведение контроля реальной на момент проведения опыта биологической концентрации (БК) тест-микроорганизма в суспензии (п. 3.3);
- внесение в испытываемый дезинфицирующий раствор рабочей суспензии тест-микроорганизма с обеспечением соотношения ДС и суспензии тест-микроорганизма 9:1;
- перемешивание смеси и отсчет по секундомеру времени начала воздействия ДС на тест-микроорганизм;
- по окончании каждой заданной экспозиции проводят отбор пробы в количестве 3 мл, которую по 1 мл вносят в 3 пробирки, содержащие по 9 мл стерильного раствора нейтрализатора;
- перемешивание пробы путем встряхивания в течение 1 - 2 мин. (или в течение 5 мин. на шейкере) и посев из них стерильно на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри (по 0,1 мл на каждую чашку и не менее чем на 3 чашки из каждой пробы).
В опытах с вирулентным тест-микроорганизмом возбудителя сибирской язвы, кроме посева на твердую питательную среду, пробу по 0,2 мл вводят внутрибрюшинно белым мышам весом по 10 - 12 г. Параллельно проводят контрольное заражение животных питательной средой с нейтрализатором и суспензией спор исходного тест-микроорганизма. Количество животных в контрольных группах - не менее 3. Наблюдают за животными в течение 48 - 96 ч. Как павших, так и усыпленных эфиром мышей вскрывают, делают посев органов на элективные среды для выявления роста возбудителя сибирской язвы и его идентификации;
- инкубирование чашек Петри с посевами проб при температуре (37 +/- 1) °С или (55 +/- 1) °С в зависимости от тест-микроорганизма в течение 2 - 7 сут. и учет результатов.
Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие жизнеспособных спор в посевах соответствующих им проб.
Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляют отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе учета данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.
Средство, растворы которого обеспечивают при комнатной температуре в течение 60 мин. полную гибель спор одного из рекомендуемых споровых тест-микроорганизмов, рассматривают как перспективное спороцидное средство для дальнейшего изучения: определения спектра спороцидного действия, факторов, влияющих на спороцидную активность ДС, и др.
5.2. Метод батистовых тест-объектов
Как и суспензионный метод оценки спороцидной активности ДС и их субстанций, так и метод батистовых тест-объектов используют для получения информации о концентрации и времени эффективного спороцидного действия ДС. В принципиальном плане методология выполнения эксперимента по оценке спороцидной активности ДС методом батистовых тест-объектов приведена на схеме рис. 4 (не приводится).
Как видно из схемы рис. 4, для проведения опыта по оценке спороцидной активности ДС методом батистовых тест-объектов необходимо приготовить:
- стерильные батистовые тест-объекты размером 1 х 0,5 см путем погружения куска батиста на 24 ч в холодную питьевую воду для удаления апплитуры. Затем ткань тщательно стирают с мылом, прополаскивают в холодной воде, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом. С помощью иглы в приготовленном куске ткани выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм друг от друга, а в поперечном направлении - 6 мм. По этим линиям батист разрезают ножницами на отдельные тест-объекты; раскладывают по 50 штук в чашки Петри, упаковывают в бумагу и стерилизуют в паровом стерилизаторе;
- рабочую суспензию тест-микроорганизма с концентрацией спор не менее 1
9
х 10 спор/мл для контаминации батистовых тест-объектов;
- пробирки со стерильной питьевой водой (10 мл) для контроля реальной биологической концентрации тест-микроорганизма на контаминированных тест-объектах;
- испытываемый раствор ДС в емкости (пробирка, колба или стакан) в количестве, достаточном для замачивания всех взятых в опыт тест-объектов, исходя из расчета 0,5 мл раствора на 1 тест-объект;
- необходимое количество пробирок (в зависимости от количества проб, отбираемых для определения времени полной гибели спор тест-микроорганизма под действием ДС), содержащих по 9 мл нейтрализатора, проверенного предварительно на эффективность нейтрализации остаточного действия испытываемого ДС на тест-микроорганизм (п. 4);
- чашки Петри со стерильной плотной питательной средой для посева проб контроля БК тест-микроорганизма на тест-объекте и проб контроля эффективности действия ДС на тест-микроорганизм.
Методика проведения самого опыта по оценке спороцидной активности ДС предусматривает, как видно из схемы, последовательное выполнение следующих операций (рис. 4):
- тщательное перемешивание хранимой в пробирке или во флаконе при
температуре (6 +/- 2) °С исходной суспензии агаровой культуры
тест-микроорганизма путем встряхивания пробирки (флакона) в течение 2 - 3
мин.; приготовление из нее рабочей суспензии тест-микроорганизма в
9
концентрации спор не менее 1 х 10 спор/мл и в количестве, достаточном для
контаминации используемых в опыте тест-объектов (из расчета 0,2 мл на
тест-объект);
- контаминация батистовых тест-объектов тест-микроорганизмом. Для этого помещают в чашку Петри необходимое для опыта количество стерильных батистовых тест-объектов; заливают их приготовленной рабочей суспензией спор тест-микроорганизма, обеспечивая их равномерное смачивание, и оставляют их в суспензии в закрытой чашке Петри на 20 мин. С соблюдением асептики контаминированные тест-объекты переносят на стерильную фильтровальную бумагу, уложенную в два слоя в стерильной чашке Петри, покрывают их листом такой же бумаги и закрывают чашку крышкой; через 10 мин. перекладывают тест-объекты на сухую стерильную фильтровальную бумагу в стерильной чашке Петри и подсушивают в термостате при (37 +/- 1) °С в течение 60 мин. с приоткрытыми крышками. Высушенные тест-объекты, контаминированные спорами тест-микроорганизма, помещают в чашке Петри в холодильник и хранят при температуре (6 +/- 2) °С, используя для проведения опытов в течение не более 3 - 4 сут.;
- с целью контроля микробной контаминации тест-объектов определяют
биологическую концентрацию спор на них. Для этого контаминированные спорами
батистовые тесты погружают в пробирки с 10 мл стерильной питьевой воды и
встряхивают в течение 10 - 15 мин. на шейкере для отмывания спор с
тест-объекта. Затем делают 3 последовательных 10-кратных разведения, чтобы
3
получить суспензию с концентрацией порядка 1 х 10 спор/мл, из которой
производят посев по 0,1 мл на 5 чашек с плотной питательной средой. Посевы
инкубируют в термостате при (37 +/- 1) - (55 +/- 1) °С в течение 2 - 4 сут.
и подсчитывают общее количество выросших на чашках КОЕ. Используя формулу
определения БК, приведенную в п. 3.3, рассчитывают количество
жизнеспособных спор тест-микроорганизма на тест-объекте;
- приготовление испытываемого рабочего раствора ДС в соответствующей емкости из расчета 0,5 - 1,0 мл на тест-объект;
- помещение испытываемого рабочего раствора ДС на водяную баню с заданной температурой. Если задачей эксперимента не предусмотрено изучение влияния воздействия температуры на эффективность средства, то оценка эффективности раствора испытываемого средства осуществляется при температуре 18 - 20 °С;
- замачивание необходимого для обеспечения отбора проб количества контаминированных тест-объектов в дезинфицирующем растворе с заданной температурой и отсчет по секундомеру времени начала воздействия ДС на тест-микроорганизм;
- отбор (по окончании каждой заданной экспозиции) стерильным пинцетом (петлей) тест-объектов (не менее 3 на экспозицию), которые помещают в пробирку с 10 мл заранее проверенного на эффективность нейтрализатора остаточного действия ДС на тест-микроорганизм.
Определение наличия жизнеспособных спор на тест-объекте. Если предусматривается только установление наличия на данную экспозицию оставшихся на тест-объекте жизнеспособных спор тест-микроорганизма, то проба не подвергается встряхиванию, а тесты стерильным пинцетом извлекают из нейтрализатора и помещают в пробирку со стерильным питательным бульоном. Если предусматривается количественное определение оставшихся на тест-объекте жизнеспособных спор тест-микроорганизма, то на стерильную плотную питательную среду в чашках Петри сеют по 0,1 мл стерильной пипеткой из нейтрализованной пробы (или из ее соответствующего разведения), полученной после интенсивного встряхивания тест-объектов вручную в течение 5 - 10 мин. на шейкере;
- инкубирование посевов в чашках Петри или пробирках проводят при температуре (37 +/- 1) - (55 +/- 1) °С в зависимости от вида тест-микроорганизма в течение 2 - 4 сут.;
- учет и анализ результатов эксперимента (испытания).
Эффективной экспозицией для рабочего раствора испытанной концентрации считается вторая экспозиция из показавших отсутствие в посевах соответствующих им проб жизнеспособных спор.