Количество и интервал (шаг) экспозиций, при которых осуществляется отбор проб на эффективность ДС, выбирают на основе данных о составе и эффективности входящих в средство действующих веществ.
Средство, растворы которого обеспечивают при комнатной температуре в течение 60 мин. полную гибель спор одного из рекомендуемых споровых тест-микроорганизмов, может рассматриваться как перспективное спороцидное ДС для дальнейшего изучения.
Исследование спектра спороцидной активности химических ДС, СС и их субстанций проводят с использованием следующих тест-микроорганизмов:
B. cereus, B. subtilis, B. anthracis, сибиреязвенной сухой живой вакцины СТИ-1. Дальнейшие исследования проводят, используя наиболее устойчивый тест-микроорганизм.
5.3. Методы изучения факторов, влияющих
на спороцидную активность ДС, СС и их субстанций
Для определения сферы применения и направлений дальнейших исследований необходимо изучить спектр спороцидной активности ДС, СС и их субстанций и зависимости его от температуры, величины рН и присутствия белковых загрязнений.
Исследования проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.2).
Определение спектра спороцидного действия ДС, СС и их субстанций используют споровые тест-микроорганизмы, рекомендуемые для изучения и оценки спороцидной активности (п. 3, табл. 1).
На основании полученных данных определяют целесообразность дальнейших исследований для применения в качестве ДС, СС и их субстанций.
Определение влияния температуры на спороцидную активность ДС, СС и их субстанций проводят с целью выявления возможности использования подогретых растворов ДС для сокращения времени обеззараживания объектов в отношении спор тест-микроорганизмов, а также для оценки эффективности спороцидных свойств при пониженных температурах окружающей среды, обеззараживаемого объекта и самого раствора ДС.
Для изучения влияния температуры рабочие растворы испытуемых ДС готовят в день опыта, наливают в стеклянные колбы (пробирки) из расчета по 0,5 мл на каждый тест-объект.
Исследование влияния положительных температур раствора ДС на его спороцидную активность проводят с использованием водяной бани, в которой нагревают емкость с дезинфицирующим раствором до (18 +/- 1) °С, (37 +/- 1) °С, (55 +/- 1) °С, после чего погружают в него зараженные тест-объекты и поддерживают эти температуры в процессе всего опыта.
Опыты по оценке влияния пониженной температуры на активность ДС проводят с использованием криостата или солевых низкозамерзающих растворов, в которых охлаждают емкость с дезинфицирующим раствором до (10 +/- 1) °С, (5 +/- 1) °С, (-20 +/- 1) °С и поддерживают эти температуры в процессе опыта. После достижения указанной температуры в раствор ДС погружают батистовые тест-объекты, контаминированные тест-микроорганизмом, из расчета 2 тест-объекта на каждую экспозицию.
Через определенные промежутки времени из каждой колбы извлекают по 2 тест-объекта и помещают их в пробирки с соответствующим нейтрализатором на 5 мин., затем во вторую пробирку со стерильной водопроводной водой на 5 мин. и только после этого каждый тест-объект переносят в пробирку, заполненную 5 мл бульона Хоттингера (pH 7,2). Посевы инкубируют в течение 48 - 72 ч при (37 +/- 1) °С. Контролем служат по 2 тест-объекта при каждой исследованной температуре, не подвергавшиеся действию испытуемого ДС, но погруженные в пробирки со стерильной питьевой водой на срок, равный действию испытуемого ДС.
Определение влияния величины pH на спороцидную активность ДС, СС и их субстанций начинают с приготовления рабочих растворов ДС, имеющих различную величину pH (5,6 - 6,0; 7,0; 8,5 - 9,0). Для подкисления раствора используют децинормальный раствор соляной или другой кислоты, а для подщелачивания - децинормальный раствор щелочи. В подготовленные растворы погружают контаминированные спорами батистовые тест-объекты. Исследование зависимости спороцидной активности ДС, СС и их субстанций от величины рН проводят по методике, описанной выше, только при нейтрализации действия действующих веществ одновременно понижают и величину pH, добавляя соответственно кислоту или щелочь.
Определение влияния белковых загрязнений на спороцидную активность ДС проводят с целью выявления возможности влияния (или установления его отсутствия) белковых загрязнений на обеззараживаемом объекте на спороцидную активность ДС.
Исследование проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.2), только для контаминации тест-объектов используют суспензию спор тест-микроорганизма, содержащую 20% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови, которые добавляют в суспензию при ее приготовлении. Инактивацию нормальной сыворотки крупного рогатого скота проводят дробным трехкратным прогреванием на водяной бане при температуре (60 +/- 1) °С в течение 30 мин. Если активность препарата не снижается в присутствии 20% белка, концентрацию инактивированной сыворотки крупного рогатого скота или дефибринированной крови в суспензии тест-микроорганизма увеличивают до 40%. Отсутствие снижения спороцидной активности ДС при добавлении 40% сыворотки позволяет считать ДС не реагирующим на присутствие белковых загрязнений.
6. Методы исследования спороцидной эффективности ДС,
предназначенных для обеззараживания объектов внешней среды,
контаминированных тест-микроорганизмами в споровой форме
Длительная выживаемость спор возбудителей сибирской язвы, газовой гангрены и столбняка во внешней среде обосновывает необходимость обеззараживания большого перечня объектов, которые могут быть контаминированы возбудителем сибирской язвы при уходе за больными животными, захоронении их трупов, транспортировании, реализации, переработке и уничтожении продуктов и сырья, полученных от больных животных, в очаге на дому при выявлении лиц, больных сибирской язвой, в лечебно-профилактических учреждениях при оказании медицинской помощи больным сибирской язвой, газовой гангреной и столбняком, в специализированных бактериологических лабораториях, работающих с этими возбудителями, на предприятиях по производству биопрепаратов на их основе, а также при биотеррористическом использовании возбудителя сибирской язвы.
Учитывая вышесказанное, перечень тест-объектов, моделирующих объекты, подлежащие дезинфекции, включает: поверхности помещений, мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического оборудования, транспортных средств и др.; изделия медицинского назначения, в т.ч. эндоскопы; предметы ухода за больными, игрушки; посуду столовую, лабораторную и из-под выделений; белье, одежду, спецодежду и другие объекты из тканей; изделия из резины, в т.ч. перчатки, сапоги, фартуки и др.; обувь; руки в резиновых перчатках; остатки пищи; выделения: фекалии, мочу, кровь, мокроту; воду; воздух; медицинские отходы.
6.1. Исследование спороцидной эффективности ДС,
предназначенных для обеззараживания поверхностей помещений,
мебели, аппаратов, приборов, санитарно-технического
оборудования, транспортных средств и других объектов
В исследованиях используют тест-поверхности (10 х 10 см) из различных материалов: дерева (окрашенные масляной или клеевой и другими красками; оклеенные обоями и неокрашенные), линолеума, пластика, кафеля, фаянса, плитки, металлов, стекла.
Тест-поверхности из различных материалов (за исключением поверхностей,
окрашенных клеевой краской и оклеенных обоями) тщательно моют водой с мылом
и щеткой, стерилизуют в паровом стерилизаторе. Тест-поверхности, окрашенные
клеевой краской и оклеенные обоями, протирают несколько раз стерильной
марлевой салфеткой, увлажненной стерильной питьевой водой. Готовят
суспензию тест-микроорганизма (B. cereus, сибиреязвенная живая сухая
9
вакцина СТИ-1 для людей, B. anthracis), содержащую 2,0 х 10 спор/мл,
добавляют 40% лошадиной сыворотки, инактивированной при 56 °С в течение 30
9
мин. (к 6 мл суспензии, содержащей 2,0 х 10 спор/мл, прибавляют 4 мл
сыворотки).
После подсыхания тест-поверхности располагают горизонтально и на них с помощью одноканального механического дозатора или стеклянной пипетки наносят 0,5 мл суспензии спор тест-микроорганизма. Суспензию равномерно распределяют по всей тест-поверхности (100 кв. см) стерильным стеклянным шпателем. Если суспензия тест-микроорганизма не распределяется равномерно, а собирается в каплю, растирание шпателем по тест-поверхности осуществляют неоднократно (3 - 5 раз). Контаминированные тест-поверхности подсушивают при комнатной температуре до полного высыхания (30 - 120 мин.). Обеззараживание тест-поверхностей осуществляют способами протирания или орошения дезинфицирующим раствором (при работе с B. anthracis применяют только орошение в боксе биологической защиты при предварительном подсушивании не более 20 мин.).
При проведении экспериментов тест-поверхности, окрашенные клеевой и другими красками или оклеенные обоями, располагают вертикально и обеззараживают путем орошения дезинфицирующим раствором. Остальные тест-поверхности обеззараживают как в горизонтальном, так и в вертикальном положениях путем орошения, однократного или двукратного протирания или мытья дезинфицирующим раствором.
В зависимости от вида обрабатываемой поверхности и наличия загрязнений на ней норма расхода ДС способом протирания равна 100 - 150 мл/кв. м (1 - 1,5 мл на 100 кв. см); способом орошения - 150 мл/кв. м (1,5 мл на 100 кв. см) при обработке распылителем типа "Квазар" или его аналогами и 300 - 500 мл/кв. м (3 - 5 мл на 100 кв. см) при обработке распылителем типа "Автомакс" или гидропультом.
При необходимости обработку способом протирания или орошения повторяют через 15 мин.
Для контроля эффективности обеззараживания через определенные промежутки времени (15 - 30 - 60 мин.) с тест-поверхностей делают смывы путем тщательного протирания тест-поверхности сначала в одном, а затем в перпендикулярном направлении стерильной марлевой салфеткой (5 х 5 см), увлажненной нейтрализатором. После протирания на тест-поверхности не должно оставаться излишней влаги. Салфетки погружают на 5 мин. в пробирки (емкости) с соответствующим для испытуемого ДС нейтрализатором (10 мл), а затем в стерильную питьевую воду с бусами и встряхивают на шейкере в течение 10 мин. Полученную смывную жидкость вносят по 0,1 мл на поверхность питательного агара двух чашек Петри, тщательно распределяя по всей поверхности. Посевы инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 48 - 72 ч.