Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов специальности 1-33 01 06 -экология сельского (стр. 2 из 4)
5. Зарисовать наблюдаемые эффекты воздействия солей тяжелых металлов.
6. На просмотренном препарате сменить раствор соли тяжелых металлов на дистиллированную воду.
7. Зарисовать происходящие изменения в препарате, заполнить таблицу 1.
8. Сделать выводы о воздействии тяжелых металлов в различных концентрациях на клетки Alium cepa.
Т а б л и ц а.1. Воздействие солей тяжелых металлов в различных концентрациях на клетки лука
| Соль | Концентрация | Воздействие тяжелых металлов |
Работа 2.Приготовление селективных питательных сред для выявления индивидуальных реакций живых организмов на токсиканты
Материалы и оборудование: колбы, стаканы на 100, 200, 500 и 1000 мл; цилиндры на 50, 100,500 и 1000 мл, аналитические весы, лабораторные весы, магнитные мешалки, электрические плиты, стеклянные палочки, соли тяжелых металлов, маточные растворы среды Мурасиге – Скуга, агар-агар, дистиллированная вода, пробирки, чашки Петри,спирт, халаты,маркеры.
Ход работы.
1.Приготовить согласно прописям (табл. 2) питательную среду Мурасиге – Скуга.
2.Добавить расчетное количество солей тяжелых металлов в состав селективных питательных сред.
3. Добавить агар-агар в состав питательной среды из расчета 7 г на 1 л среды.
4.Нагреть питательные среды до расплавления агар-агара и разлить по пробиркам.
5.Закрыть пробирки ватно-марлевыми пробками и простерилизовать в автоклаве.
Расчет необходимого количества соли тяжелого металла исходя из концентрации иона тяжелого металла вычисляют по формуле
,где Х – необходимая масса соли;
С – концентрация металла в растворе;
Мr– молекулярная масса соли тяжелого металла;
Аr – атомная масса находящегося в ней металла.
Т а б л и ц а 2. Состав среды Мурасиге – Скуга из маточных растворов
| Компоненты среды | Маточный раствор, г/л | Количество маточного раствора для приготовления 1л среды, мл |
| Макросоли, г/л: | 100 | |
| KNO3 | 19,0 | |
| NH4NO3 | 16,5 | |
| KH2PO4 | 17,0 | |
| MgSO4.7H2O | 3,7 | |
| CaCl2.H2O | 4,4 | |
| Fe-хелат, г/л: | 5 | |
| FeSO4. 7H2O | 5,57 | |
| Na2ЭДТА. 2H2O | 7,45 | |
| Микросоли, мг на 200 мл: | 10 | |
| H3BO3 | 124 | |
| MnSO4. 4H2O | 482 | |
| ZnSO | 172 | |
| KI | 16,6 | |
| Na2MoO4. 2H2O | 5,0 | |
| CuSO4 | 0,5 | |
| CoCl2. 2H2O | 0,5 | |
| Витамины, мг на 200 мл: | 10 | |
| пиридоксин HCl (В6) | 10 | |
| тиамин – HCl (В1) | 2 | |
| никотиновая кислота (РР) | 10 |
Работа 3. Влияние токсических веществ
на микроорганизмы. Токсины микроорганизмов
Материалы и оборудование: колбы и стаканы на 200, 500, 1000 мл, готовые питательные среды с содержанием различных концентраций солей тяжелых металлов, боксы для посева микроорганизмов, микробиологические петли, спирт, дистиллированная вода, газовая горелка, штаммы микроорганизмов, халаты, маркеры, резиновые перчатки.
Микроорганизмы бывают анаэробными и аэробными. Большинство патогенных микроорганизмов – анаэробны и способны вырабатывать токсины. Вирулентность (выживаемость) микроорганизмов зависит от внешних факторов окружающей среды и организма хозяина, в благоприятных условиях она равна 100 %. По мере изменения микроорганизмов и возникновения у них высокопатогенных признаков организм хозяина вырабатывает иммунитет к патогенным признакам – теория "ген и антиген".
Микроорганизмы способны вырабатывать токсины сами и, поглощая из питательной среды токсические вещества, могут существовать в высокоагрессивных средах. Токсические вещества микроорганизмов приводят к нарушению жизнедеятельности организма хозяина, его интоксикации (отравлению) и гибели. Если организм выживает, то он приобретает иммунитет к воздействию этих токсинов. Невосприимчивость бывает длительной (оспа) и кратковременной ( грипп). Микроорганизмы способны изменять среду обитания, делая её для себя максимально благоприятной. Например, гриб Penicillium notatum вырабатывает пенициллин – токсин, уничтожающий большинство других микроорганизмов-конкурентов или замедляющий их развитие – явление аллелопатии. Грибы Aspergilus albus и Aspergilus niger вырабатывают токсины, выделяемые ими в окружающую среду, делая её ядовитой для других организмов, при этом она остаётся приемлемой для него. Споры их могут быть токсическими для теплокровных организмов, вызывая их гибель. При жизнедеятельности на загрязненных субстратах микроорганизмы способны быстро видоизменяться, приспосабливаться к уровню токсичности среды. При этом они включают в свой метаболизм токсиканты, находящиеся в субстрате. Например, при высокой концентрации меди в субстрате некоторые микроорганизмы способны повышать концентрацию меди в спорах по сравнению с контролем до 500 раз. Развиваясь на загрязненных субстратах, зачастую, микроорганизмы способны увеличивать выработку собственных токсинов.
Микроорганизмы по способу проникновения в субстраты бывают:
а) поверхностные;
б) проникающие;
в) лизирующие (разжижающие субстрат);
г) внутрисубстратные.
Микроорганизмы способны накапливать в себе свои токсины либо выделять их в субстрат. Микроорганизмы, накапливающие в себе токсины, концентрируют их в вакуолях, эндоплазматической сети, аппаратах Гольджи, на мембранах. Способность проникновения токсинов в клетку зависит от уровня сродства к липопротеинам либо от способности разрушать мембраны клеток, при этом обычно нарушается ферментативный обмен клеток.
Ход работы.
1.Подготовить к работе ламинар-бокс и инструменты, используя 96% -ный спирт.
2.Провести стерилизацию оборудования, рук 70 %-ным спиртом.
3.С помощью микробиологической петли произвести посадку микроорганизмов на питательные среды.
4.Поместить зараженные микроорганизмами питательные среды в термостат.
5. Культивировать в течение 7–21 дня патогенные микроорганизмы при температуре 37 0 С, сапрофитные микроорганизмы – при температуре 25-27 0 С.
6.По истечении срока культивирования произвести снятие результатов эксперимента и заполнить табл. 3.
7.Сделать выводы о влиянии различных форм и концентраций солей тяжелых металлов на микроорганизмы.
Т а б л и ц а 3. Влияние токсических веществ на микроорганизмы
| Признаки | Растворы солей тяжелых металлов | |||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 1.Степень угнетения, % | ||||||||||||
| 2.Плотность покрова | ||||||||||||
| 3.Наличие спороношения | ||||||||||||
| 4.Степень врастания в питательную среду | ||||||||||||
| 5.Наличие продуктов метаболизма | ||||||||||||
| 6.Цвет коллоний | ||||||||||||
| 7.Профиль коллоний | ||||||||||||
Работа 4. Особенности регенерации растений
in vitrо на токсинсодержащих субстратах
Материалы и оборудование: пинцеты, ножницы, спирт, стерильные матрасики, скальпель, вата, стерильные растения, пробирки со стерильными токсинсодержащими питательными средами, ламинар-бокс, газовая горелка, халаты, маркеры.
Ход работы.
1.Подготовить к работе ламинар-бокс.
2.Провести стерилизацию оборудования и инструментов 96 %-ным спиртом и рук –70 %-ным спиртом.
3. Стерильные растения пинцетом достать из пробирки и, поместив на стерильный матрасик, разрезать на части, содержащие интерколярную почку.
4.Полученные черенки высадить в пробирки с токсинсодержащей питательной средой. В качестве контроля использовать питательные среды, не содержащие токсических веществ.
5.Культивировать растения in vitro в течение 3 – 4 недель в условиях культуральной комнаты (t =24 –26 0С, влажность 70 – 80%, фотопериод 16–18 ч).
6. По истечении срока культивирования произвести описание растений in vitro и заполнить табл. 4.
7. По результатам эксперимента сделать выводы.
Т а б л и ц а 4. Влияние токсинсодержащих сред на регенерацию растений in vitro
| Вариант | Вид растений | Примечание | ||||
| Степень регенерации, % | Высота растения -реге- неранта, см | Количество листьев, шт. | Колич. корней, шт. | Длина корней, см | ||
Работа 5. Морфологические особенности
воздействия токсикантов на растения in vivo
Материалы и оборудование: стеклянные лабораторные опрыски-
ватели, изоляторы, растения в горшочках, соли тяжелых металлов, спирт , резиновые перчатки, распираторы, халаты, пинцеты, зажимы, мерные цилиндры, стеклянные стаканы на 100, 200, 500 мл, дистиллированная вода, маркеры.
У растений проявляется генетически обусловленная видовая и сортовая специфика по накоплению токсикантов в продукции. Например, отмечено, что накопление кадмия у салата разных сортов различалось более чем в 300 раз. Наблюдается специфика накопления тяжёлых металлов в различных органах растений. Концентрация тяжёлых металлов уменьшается в следующем направлении: корни ®стебли ®листья