3. Т-клеточные вакцины в терапии хронического
гепатита В
Еще один терапевтический подход с использованием Т-клеточной вакцины для лечения больных хроническим гепатитом В, разрабатывался Heathcote at al.[17]. Вакцина представляет собой липопептид, состоящий из ковалентно связанных компонентов: цитотоксического Т-клеточного эпитопа, полученного из сердцевинного белка HBV (18-27 аминокислоты), Т-хелперного эпитопа, выделенного из столбнячного токсоида, и двух молекул пальмитиновой кислоты. В исследованиях с участием 26 здоровых людей была продемонстрирована безопасность вакцины и ее способность индуцировать первичный HBV core-специфичный CTL-ответ [11]. Была построена дозо-зависимая кривая, и пять из пяти испытуемых “ответили” на самую высокую дозировку (500 mg). В пробном исследовании вакцина вводилась 19 пациентам с хроническим гепатитом В с целью инициировать in vivo CTL -реакцию, ответственную за клиренс вируса [17]. Вакцинация самой высокой дозой (5 mg за 6 инъекций) вызывала ответную реакцию CTL, которая была в 10 раз слабее аналогичной у здоровых испытуемых [18]. Никаких значительных изменений в “печеночной”биохимии или вирусной серологии (HВeAg, a-HВeAb, HBV-ДНК) не наблюдалось. Представляет интерес тот факт, что также не было отмечено серьезных побочных эффектов. В целом, введение одно-эпитопной вакцины инициирует активность CTL у хронических носителей HBV, однако в значительно меньшей степени, чем у пациентов, выздоровевших после перенесенной острой HBV-инфекции. Было сделано предположение, что нарушение функции хелперных Т-лимфоцитов, ассоциированное с хронической HBV-инфекцией, возможно является причиной неудачных попыток индуцировать с помощью вакцины стойкий и эффективный CTL-ответ у хронически инфицированных больных. Было обнаружено, что секреция Th1-лимфокинов - g-IFN и IL-12 – снижается с одновременным повышением продукции Th0/Th2-лимфокина – IL-5 [19]. Последние исследования показали, что антивирусная терапия (ламивудин) может восстанавливать функции Th-клеток у пациентов с хронической HBV-инфекцией [20]. Эти данные говорят в пользу комбинированного подхода к терапии с использованием либо специфических, либо неспецифических иммуностимуляторов (IL-12, IFN-g) и антивирусных препаратов для восстановления нарушенной Th функции.
4. ДНК вакцины и HBV-инфекция
Недавно нами было разработано новое направление вакцинотерапии HBV-инфекции, основанное на внутримышечном введении плазмидной ДНК, кодирующей HBV-антиген [21, 22]. Так называемые “ДНК-вакцины” вызывают иммунный ответ против антигенов, синтезируемых in vivo после непосредственного введения ДНК, кодирующих антигенные последовательности. Этот новый подход к иммунизации позволит избежать недостатков традиционного «антигенного» подхода и обеспечит безопасность и эффективность профилактических и терапевтических вакцин.
Систематическая иммунизация мышей путем внутримышечного введения плазмидной ДНК, экспрессирующей белки оболочки HBV и HВsAg, индуцирует быстрый, мощный и стойкий гуморальный и клеточный иммунный ответ. Антитела, первоначально IgM, а затем IgG изотипов (преимущественно IgG2a), распознают несколько В-клеточных эпитопов, представленных на S, preS2 или preS1 доменах белков оболочки [22, 23]. Высокие титры анти-HBs наблюдаются к 4-8 неделе и сохраняются в течение, по меньшей мере, 17 месяцев после однократной ДНК-инъекции, в то время как второе введение вакцины приводит к их десятикратному увеличению. Несколько слабее эффект оказывает введение рекомбинантного HВsAg [24]. ДНК-иммунизация приводит к развитию мощного клеточного иммунного ответа с высоким уровнем CTL и их предшественников, выявляемых уже через неделю и сохраняющихся в течение нескольких месяцев [25, 26]. ДНК-вакцины выступают также в качестве собственных адьювантов, благодаря присутствию бактериальных CpG мотивов, обладающих иммуностимуляторными свойствами. Подобные последовательности, присутствующие в плазмидном каркасе, активируют Th1-лимфоциты с преобладающим синтезом IL-12 и g-IFN и незначительной секрецией Th2-цитокинов [27].
Иммунизация мышей, трансгенных по HLA A2.1 и с “выключенными” (knock-out) молекулами класса I MHC, ДНК, кодирующей HВsAg, показала, что эпитопы, присутствующие после процессинга in vivo у HLA A2 Tg мышей очень близки тем, что появляются у человека в ходе HBV-инфекции [30].
Благодаря эндогенному синтезу антигена, процессированию в соответствующие эпитопы и индукции CD8+ CTL ДНК-вакцины могут использоваться для лечения больных хроническим гепатитом В. В качестве модели для изучения возможности с помощью ДНК-вакцин индуцировать иммунный ответ у хронических HBV-носителей мы использовали Tg, экспрессирующих HВsAg только в печени. Исследуемые трансгенные мыши секретировали в огромном количестве HВsAg без образования антител и заметной печеночной патологии. Используя плазмидную ДНК, кодирующую малый и средний поверхностные белки HBV, мы добились появления анти-HBs антител у Tg мышей, которые в свою очередь способствовали клиренсу циркулирующего HВsAg. Элиминация антигена, носящая стойкий характер, коррелировала также со снижением уровня или исчезновением информационной HBV РНК из печени [28]. Эксперименты по переносу фракционированных HВsAg-примированных спленоцитов, полученных от ДНК-иммунизированных мышей, Tg мышам показали, что и CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты в состоянии контролировать трансгенную экспрессию даже в отсутствии антител. Результаты, полученные в экспериментах с мышами, трансгенными по HВsAg, с “выключенным” геном рецептора для g-IFN показали, что регуляция матричной РНК оболочки HBV осуществляется цитокинами 1 типа, продуцируемыми активированными Т-лимфоцитами [29].
Полученные результаты указывают на возможность разработки более эффективных способов предупреждения и терапии HBV-инфекции. Однако, немало базовых вопросов, касающихся вакцинотерапии, еще не имеет ответов, например безопасность введения ДНК-вакцин и потенциально возможные побочные эффекты от чрезмерно сильной цитотоксической реакции, направленной против инфицированных клеток печени.
5. Заключение
Цель исследований, описанных выше, состоит в создании терапевтической вакцины против персистирующей HBV-инфекции, что представляет огромное значение для людей, имеющих хронические заболевания печени с высоким риском развития гепатоцеллюлярной карциномы. Вакцинация, таким образом, может стать достаточно эффективной терапевтической процедурой, имеющей к тому же более низкую стоимость. Так как хронические носители – это основной источник распространения инфекции, контроль над заболеванием в их среде будет способствовать контролю над HBV-инфекцией в целом.
Цитируемая литература
[1] Lee WM. Hepatitis B virus infection. New Engl J Med 1997;337:1733–45.
[2] Hoofnagle JH, Lau D. New therapies for chronic hepatitis B. J Viral Hepat 1997;4:41–50.
[3] Hoofnagle JH, di Bisceglie AM. The treatment of chronic viral hepatitis. New Engl J Med 1997;336:347–56.
[4] Peters M, Vierling J, Gershwin ME, Milich D, Chisari FV, Hoofnagle JH. Immunology and the liver. Hepatology 1991;13:977–94.
[5] Lai CL, Chien RN, Leung NW, Chang TT, Guan R, Tai DI, Ng KY, Wu PC, Dent JC, Barber J, Stephenson SL, Gray DF. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group. New Engl J Med 1998;339:61–8.
[6] Chisari FV. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Annu Rev Immunol 1995;13:29–60.
[7] Bertoletti A, D’Elios MM, Boni C, De Carli M, Zignego AL, Durazzo M, Missale G, Penna A, Fiaccadori F, Del Prete G, Ferrari C. Different cytokine profiles of intraphepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infections. Gastroenterology 1997;112:193–9.
[8] Jung MC, Hartmann B, Gerlach JT, Diepolder H, Gruber R, Schraut W, Gruner N, Zachoval R, Hoffmann R, Santantonio T, Wachtler M, Pape GR. Virus-specific lymphokine production differs quantitatively but not qualitatively in acute and chronic hepatitis B infection. Virology 1999;261:165–72.
[9] Penna A, Del Prete G, Cavalli A, Bertoletti A, D’Elios MM, Sorrentino R, D’Amato M, Boni C, Pilli M, Fiaccadori F, Ferrari C. Predominant T-helper 1 cytokine profile of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B. Hepatology 1997;25:1022–7.
[10] Couillin I, Pol S, Mancini M, Driss F, Brechot C, Tiollais P, Michel ML. Specific vaccine therapy in chronic hepatitis B: induction of T cell proliferative responses specific for envelope antigens. J Infect Dis 1999;180:15–26 published erratum appears in J. Infect. Dis. 1999 Nov;180(5):1756.
[11] Vitiello A, Ishioka G, Grey HM, Rose R, Farness P, LaFond R, Yuan L, Chisari FV, Furze J, Bartholomeuz R, et al. Development of a lipopeptide-based therapeutic vaccine to treat chronic HBV infection. I. Induction of a primary cytotoxic T lymphocyte response in humans. J Clin Invest 1995;95:341–9.
[12] Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Annu Rev Immunol 1997;15:617–48.
[13] Michel M-L. Les vaccins a` base d’ADN. Virologie 1997;1:283– 90.
[14] Mancini M, Hadchouel M, Tiollais P, Pourcel C, Michel M-L. Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies in HBsAg transgenic mice: a possible way of circumventing ‘nonresponse’ to HbsAg. J Med Virol 1993;39:67–74.
[15] Pol S, Driss F, Michel M-L, Nalpas B, Berthelot P, Brechot C. Specific vaccine therapy in chronic hepatitis B infection. Lancet 1994;344:342.
[16] Pol S, Couillin I, Michel ML, Driss F, Nalpas B, Carnot F, Berthelot P, Brechot C. Immunotherapy of chronic hepatitis B by anti HBV vaccine. Acta Gastro-Enterol Belg 1998;61:228–33.
[17] Heathcote J, McHutchison J, Lee S, Tong M, Benner K, Minuk G, Wright T, Fikes J, Livingston B, Sette A, Chestnut R. A pilot study of the CY- T-cell vaccine in subjects chronically infected with hepatitis B virus. The CY1899 T Cell Vaccine Study Group. Hepatology 1999;30:531–6.
[18] Livingston BD, Crimi C, Grey H, Ishioka G, Chisari FV, Fikes J, Chesnut RW, Sette A. The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection. J Immunol 1997;159:1383–92.
[19] Livingston BD, Alexander J, Crimi C, Oseroff C, Celis E, Daly K, Guidotti LG, Chisari FV, Fikes J, Chesnut RW, Sette A. Altered helper T lymphocyte function associated with chronic hepatitis B virus infection and its role in response to therapeutic vaccination in humans. J Immunol 1999;162:3088–95.
[20] Boni C, Bertoletti A, Penna A, Cavalli A, Pilli M, Urbani S, Scognamiglio P, Boehme R, Panebianco R, Fiaccadori F, Ferrari C. Lamivudine treatment can restore T cell responsiveness in chronic hepatitis B. J Clin Invest 1998;102:968–75.
[21] Davis HL, Michel M-L, Whalen RG. DNA based immunization for hepatitis B induces continuous secretion of antigen and high levels of circulating antibody. Hum Mol Genet 1993;2:1847–51.
[22] Michel M-L, Davis HL, Schleef M, Mancini M, Tiollais P, Whalen RG. DNA-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice: aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:5307–11.
[23] Mancini M, Davis HL, Tiollais P, Michel M-L. DNA-based immunization against the envelope proteins of the hepatitis B virus. J Biotechnol 1996;44:47–57.
[24] Davis HL, Mancini M, Michel M-L, Whalen RG. DNA-mediated immunization to hepatitis B surface antigen: longevity of primary response and effect of boost. Vaccine 1996;14:910–5.
[25] Davis HL, Schirmbeck R, Reimann J, Whalen RG. DNA-mediated immunization in mice induces a potent MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocyte response to the hepatitis B envelope protein. Hum Gene Ther 1995;6:1447–56.
[26] Loirat D, Li Z, Mancini M, Tiollais P, Paulin D, Michel ML. Muscle-specific expression of hepatitis B surface antigen: no effect on DNA-raised immune responses. Virology 1999;260:74–83.
[27] Sato Y, Roman M, Tighe H, Lee D, Corr M, Nguyen MD, Silverman GJ, Lotz M, Carson DA, Raz E. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science 1996;273:352–4.
[28] Mancini M, Hadchouel M, Davis HL, Whalen RG, Tiollais P, Michel ML. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:12496–124501.
[29] Mancini M, Hadchouel M, Tiollais P, Michel ML. Regulation of hepatitis B virus mRNA expression in a hepatitis B surface antigen transgenic mouse model by IFN-gamma-secreting T cells after DNA-based immunization. J Immunol 1998;161:5564–70.
[30] Loirat D, Lemonnier FA, Michel ML. Multiepitopic HLA-A* 0201-restricted immune response against hepatitis B surface antigen after DNA-based immunization. J Immunol 2000;165:4748–4755.