2. В чем заключается взаимосвязь биотехнологии с другими науками?
3. Каковы основные направления развития биотехнологии?
4. Перечислите основные стадии биотехнологического производства.
5. Что такое посевной материал?
6. Как готовят посевной материал в производственных условиях?
7. Какие компоненты входят в состав питательных сред?
8. Что такое ферментация?
9. Какими методами осуществляется разделение биомассы от культуральной жидкости?
10. В каком случае необходима дезинтеграция клеток?
11. Какие способы концентрирования продукта Вам известны?
1. Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. Биотехнология. Проблемы и перспективы.- М.: Высшая школа, 1987.- 160 с.
2. Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. Биотехнология. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов.- М.: Высшая школа, 1987.- 142 с.
3. Габинская О.С. Основы биотехнологии. Кемерово, 1996.- 54 с.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2
Тема: Принципы составления питательных сред в биотехнологическом производстве. Особенности роста микроорганизмов на питательных средах различного состава
Цель работы: Ознакомиться с основными принципами составления питательных сред для культивирования микроорганизмов. Изучить потребности микроорганизмов в источниках питания.
Посуда, материалы, оборудование, реактивы: колбы с ватными пробками на 250 мл – 6; стеклянные палочки – 6; пипетки градуированные на 5 мл – 3, на 1мл – 6; цилиндры мерные на 250 мл – 1, на 100 мл – 1; воронки 6; стеклянные стаканчики на 50 мл – 6; фильтры бумажные складчатые; фильтровальная бумага. Весы электронные; рефрактометр; иономер; термостат; реактивы для приготовления питательных сред. Культура гриба Aspergillus niger, спиртовка, бактериологическая петля, карандаш по стеклу.
Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие микроорганизмов, эффективный синтез целевого продукта. Неотъемлемой частью питательной среды служит вода, все процессы жизнедеятельности протекают только в водной среде.
Питательные среды могут иметь неопределенный состав, то есть включать биогенные добавки - мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д. Подобные среды обычно готовят на водопроводной воде. Применяют также среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях - синтетические среды. Смесь веществ, как правило, вносят в дистиллированную воду. С экономической точки зрения выгодно употребление природного, более дешевого сырья. Однако применение синтетических сред позволяет изучить физиолого-биохимические свойства микроорганизмов и оптимизировать состав среды. Компромиссным вариантом является использование полусинтетических сред, в состав которых вместе с химически чистыми соединениями входят биогенные добавки.
Состав среды определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и метаболические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах.
Питательные среды для культивирования микроорганизмов содержат большое количество необходимых компонентов, основным из которых считают тот, который служит микроорганизмам источником углерода и энергии. Это вещество или смесь веществ называется субстратом, а все остальные - вспомогательными веществами.
Так как микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, потенциальными ресурсами для биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ. При выборе сырья необходимо учитывать его влияние на себестоимость готового продукта, доступность, методы получения, свойства и качественные характеристики.
Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется особенностями данного вида. В самом приближенном виде физиологические потребности микроорганизмов в питательных веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки: обычно содержание углерода находится в пределах 45-55%, азота – 6-14, К – 0,5-2, Р – 1-3, Mg – 0,1-1, S – 0,02-1, Ca – 1%.
Источники углерода
Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза. За ними следуют многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, которые могут быть источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо микроорганизмы должны иметь набор ферментов, гидролизующих эти вещества (Aspergillus, Bacillus, Penicillium и др.).
На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях.
Низкомолекулярные спирты: метанол и этанол - относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов Pichia, Candida и др. и бактерии рода Flavobacterium используют в качестве единственного источника углерода метанол.
Некоторые виды микроорганизмов используют в качестве источника углерода и энергии н-алканы и некоторые фракции нефти. Особенностью углеводородов является их низкая растворимость в воде, поэтому только незначительная часть микроорганизмов способна ассимилировать углеводороды.
Источники азота
Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т.д., которые легко усваиваются микроорганизмами.
Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем грибы, актиномицеты и дрожжи.
Источники фосфора
Фосфор является важнейшим компонентом клетки, он входит в состав АТФ, АДФ, АМФ и обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков и нуклеиновых кислот и др. биохимических превращений. Фосфор вносится в среду в виде солей фосфорной кислоты.
Вода
Вода должна отвечать требованиям ГОСТ (чистая, бесцветная, без привкуса, запаха и осадка).
Источники витаминов и микроэлементов
Потребность у микроорганизмов в этих соединениях различна, тем не менее, практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В рецептуры сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и др. продукты.
Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микроорганизмы.
Итак, состав питательной среды для каждого микроорганизма устанавливают экспериментально.
Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного вида микроорганизма, - выбрать такие источники углерода, азота, фосфора и др. веществ, которые наиболее оправданы в экономическом и экологическом отношениях.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
П е р в о е з а н я т и е
1. Подготовка питательной среды.
2. Определение содержания сухих веществ в питательной среде.
3. Определение рН питательной среды.
4. Подготовка посевной суспензии и засев питательной среды.
5. Установка колб в термостат.
Подготовка питательной среды
Среду заданного состава (табл. 1) готовят в колбах на 250 мл. Все компоненты растворяют в небольшом количестве водопроводной воды, затем объем доводят до 100 мл водопрводной водой. Колбы со средой закрывают ватными пробками.
Определение рН питательной среды
В стеклянный стаканчик отбирают 25 мл содержимого каждой из колб и с помощью иономера определяют рН среды.
Таблица 2.1
Варианты питательных сред
| Компоненты, | Вариант | ||||||
| на 100 мл среды | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Сахароза, г | - | 3 | - | - | - | - | |
| Глюкоза, г | 3 | - | - | 3 | 6 | 3 | |
| Лактоза, г | - | - | 3 | - | - | - | |
| Na NO3 (20% р-р), мл | 5 | 5 | 5 | 5 | 10 | 5 | |
| KH2PO4 (10% р-р), мл | 2 | 2 | 2 | 2 | 4 | 2 | |
| KСl (5% р-р), мл | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | |
| MgSO4×7H2O (1% р-р), мл | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | |
| FeSO4×7H2O (1% р-р), мл СаО ( 10 % р-р ), мл Витамины РН | 1 0,3 - 6,5-6,8 | 1 0,3 - 6,5-6,8 | 1 0,3 - 6,5-6,8 | 1 0,3 + 6,5-6,8 | 2 0,6 - 6,5-6,8 | 1 0,3 - 4 | |
Определение содержания сухих веществ в питательной среде