Методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов специальностей 270900 “Технология мяса и мясных продуктов” и 271100 “Технология молока и молочных продуктов” дневной и заочной форм (стр. 4 из 8)
Определение проводят с помощью рефрактометра. Перед началом работы рефрактометр проверяют по дистиллированной воде, при этом пунктирная линия, нанесенная на окуляр, должна совместиться с границей света и тени на нулевой отметке шкалы, значение при этом составляет 1,333.
Затем на призмы с помощью стеклянной палочки наносят несколько капель исследуемой жидкости. Верхнюю призму опускают и плотно прижимают к нижней. После этого перемещают окуляр вдоль прорези, пока граница света и тени не совместится с пунктирной линией. По шкале прибора отмечают деление, через которое проходит граница светотени. После определения поверхность призмы протирают фильтровальной бумагой и промывают дистиллированной водой.
Подготовка посевной суспензии и засев питательной среды
Для получения посевной суспензии в пробирку с чистой культурой гриба-продуцента вблизи пламени спиртовки наливают 9 мл стерильной воды. Бактериологической петлей осторожно соскребают слой, содержащий споры, до образования суспензии.
Засев питательной среды производят стерильными пипетками. Из пробирки отбирают по 1 мл суспензии и количественно переносят в каждую колбу с питательной средой. Колбы закрывают ватными пробками.
Установка колб в термостат
Каждую колбу подписывают (группа, фамилия, вариант среды) и устанавливают в термостат на 7 суток при температуре 27°С.
В т о р о е з а н я т и е
1. Отделение биомассы гриба.
2. Определение массы сухого мицелия.
3. Определение содержания сухих веществ в культуральной жидкости.
4. Определение рН в культуральной жидкости.
Отделение биомассы гриба
На аналитических весах взвешивают пустые бумажные фильтры, предварительно высушенные до постоянной массы (вес записывают), и вставляют в воронки. Колбу открывают, и содержимое фильтруют через фильтр. Отделенная от культуральной жидкости биомасса гриба является материалом для определения массы сухого мицелия. После фильтрования замеряют объем культуральной жидкости и доводят до 100 мл дистиллированной водой.
Определение массы сухого мицелия
Фильтры с биомассой гриба помещают в сушильный шкаф при температуре 130°С на 40 мин (до полного высушивания). Затем фильтры переносят в эксикатор для охлаждения на 10-15 мин, после чего взвешивают на аналитических весах. Разность между массой фильтра с сухим мицелием и массой пустого фильтра является массой сухого мицелия (Х), образовавшегося за период культивирования гриба в термостате:
Х = Мм - Мф , (2.1)
где Х – масса сухого мицелия, г; Мф - масса пустого фильтра, г; Мм - масса фильтра с высушенным мицелием, г.
Определение содержания сухих веществ в культуральной жидкости
Определение проводят с помощью рефрактометра (см. занятие 1).
Определение рН в культуральной жидкости
рН фильтрата определяют с помощью иономера (см. занятие 1).
Отношение прироста биомассы гриба к количеству потребленного субстрата называют экономическим коэффициентом.
На основании полученных данных для каждого варианта рассчитывают экономический коэффициент (Y) по формуле:
 Y = | Х-Хо S-So | , (2.2) |
где Y – экономический коэффициент; Х - масса сухого мицелия, г; Хо - масса посевного материала, г; S - концентрация сухих веществ в питательной среде, %; Sо - концентрация сухих веществ в культуральной жидкости, %.
Так как Хо часто бывает пренебрегаемо мало, то
| Y = | Х S-So | , (2.3) |
Таким образом, экономический коэффициент или выход биомассы показывает массу клеток продуцента на единицу субстрата.
Общая скорость роста микроорганизма-продуцента (V) характеризуется абсолютным приростом биомассы за единицу времени:
 V = | Х-Х0 t2-t1 | , (2.4) |
где V - общая скорость роста, г/сут; Х0 - масса посевного материала, г; Х - конечная концентрация биомассы, г; t2-t1 - время культивирования, сут.
Полученные результаты вносят в таблицу 2. На основании полученных данных делают вывод о физиолого-биохимических особенностях гриба Aspergillus niger и выбирают оптимальный состав среды.
Таблица 2.2
Журнал наблюдений
| № п/п | РН | Содержание сухих веществ, % | Масса сухого | Экономи-ческий | Общая скорость | ||
| до | после | до | после | мицелия, | коэффи- | роста, | |
| культивирования | культивирования | г/100 мл | циент | г/сутки | |||
Контрольные вопросы:
1. Что такое субстрат?
2. Какие источники углерода используют в биотехнологическом производстве?
3. Какие источники азота усваиваются микроорганизмами?
4. Как вносится фосфор в питательную среду?
5. Каким образом в питательные среды вводят источники витаминов и микроэлементов?
6. Как определяют содержание сухих веществ в питательной среде?
Список рекомендуемой литературы
1. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология.- М.: Агропромиздат, 1990.- с.96-108.
2. Габинская О.С. Основы биотехнологии: Учебное пособие.- Кемерово: КемТИПП, 1996.-54 с.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
Тема: Получение лимонной кислоты путем культивирования плесневого гриба поверхностным способом на жидкой питательной среде
Цель работы: Ознакомиться с методами поверхностного культивирования на жидких питательных средах. Изучить способность плесневого гриба к продуцированию лимонной кислоты на жидких питательных средах различного состава.
Посуда, материалы, оборудование, реактивы: колбы объемом 250 мл с ватными пробками – 5; стеклянные палочки – 5; пипетки градуированные на 5 мл – 3, на 1мл – 5; цилиндры мерные на 250 мл – 1, на 100 мл – 1; воронки диаметром 10-15 см - 5; стеклянные стаканчики на 50 мл – 5; бюретка для титрования на 25 мл. Фильтры складчатые - 5; фильтровальная бумага; спиртовка; бактериологическая петля; карандаш по стеклу. Весы электронные; рефрактометр; иономер; термостат; магнитная мешалка; сушильный шкаф. Реактивы: меласса 21,2 %, сахароза, растворы солей - NH4Cl, KH2PO4, ZnSO4, 10% K4[Fe(CN)6], 0,1 н раствор NaOH, фенолфталеин, пробирки с чистой культурой Aspergillus niger - 2, пробирки со стерильной водой -2.
Краткие теоретические положения
Лимонная кислота впервые была выделена из сока лимона и перекристаллизована Шееле. В лимонах содержится 7-9% этой кислоты; в Италии и Испании до сих пор ее получают из лимонов, но на 99% ее продукция основана на микробиологическом синтезе.
Способность грибов образовывать лимонную кислоту при росте на средах с углеводами впервые была установлена немецким ученым Вемером в 1893 г.
Большая часть лимонной кислоты (70%) используется в пищевой промышленности, около 12% в фармацевтической промышленности и около 18% - для технических целей. Использование лимонной кислоты в пищевой промышленности обусловлено ее хорошей растворимостью, низкой токсичностью и приятным кислым вкусом. Лимонную кислоту используют при приготовлении безалкогольных напитков, мармелада, вафель, пастилы, некоторых сортов колбас и сыра, для получения сгущенного молока. Лимонная кислота сохраняет естественный вкус и аромат мяса в замороженном виде при длительном хранении. Применение находят и побочные продукты ферментации: мицелий грибов и культуральная жидкость. Мицелий высушивают и используют как сырье или добавляют к удобрениям. В культуральной жидкости обнаружены гидролитические ферменты пектиназа, протеаза, целлюлаза.
Для получения лимонной кислоты используют грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, и др.
В настоящее время основными продуцентами лимонной кислоты являются различные штаммы гриба Aspergillus niger, которые отличаются большой скоростью роста, легкостью культивирования и высоким выходом лимонной кислоты к массе окисляемого углевода.
Лимонная кислота - обычный метаболит цикла трикарбоновых кислот, в небольшом количестве присутствует в клетках разных микроорганизмов. Некоторые грибы (в первую очередь A. niger) способны синтезировать огромное количество этой кислоты. Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточном содержании источника углерода.
В условиях лимитирования роста гриба недостатком одного или нескольких минеральных компонентов (Fe, Mn, N, Р или S) после полного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду. В процессе ферментации можно выделить две фазы: 1) активного роста гриба и 2) интенсивного кислотообразования, рост мицелия в этот период становится незначительным.