Методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов специальностей 270900 “Технология мяса и мясных продуктов” и 271100 “Технология молока и молочных продуктов” дневной и заочной форм (стр. 5 из 8)
В настоящее время получение лимонной кислоты биотехнологическими способами широко применяется в промышленности. Разработаны технологии получения лимонной кислоты как поверхностным, так и глубинным способами. Основной питательной средой в обоих случаях служит меласса - отход сахарного производства, она содержит 48-50% сахара. Для хорошего роста и развития гриба среда должна содержать минеральные соли: NH4Cl, KH2PO4, ZnSO4.
В мелассе содержатся соли тяжелых металлов, угнетающие рост гриба и образование лимонной кислоты. Для осаждения этих солей к мелассе добавляют желтую кровяную соль K4[Fe(CN)6].
Поверхностное культивирование осуществляется в алюминиевых или выполненных из нержавеющей стали больших кюветах. Стерильную питательную среду заливают в чистые стерильные кюветы слоем 8-12 см. Посевной материал вносят в виде суспензии и распределяют по всей поверхности среды. По окончании процесса культивирования лимонную кислоту выделяют из культуральной жидкости. Различают три основных способа ведения процесса: бессменный, сменный и доливной.
При бессменном способе рост и кислотообразование гриба происходят на одной и той же питательной среде, содержащей минеральные соли и источник углерода.
Сменный способ культивирования часто называют методом готовых пленок. Пленку гриба выращивают на питательной среде, содержащей минеральные соли и углевод. По окончании роста гриба питательный раствор из под пленки сливают, пленку промывают стерильной водой и под нее подводят новую среду для кислотообразования, содержащую углевод, но лишенную минеральных соединений.
Способ долива – через 6-7 сут от начала цикла, когда содержание сахара снизится до 3-4%, подливают свежий раствор мелассы (без питательных солей) в количестве 30-35% начального объема. В результате продолжительность ферментации увеличивается от 8-9 до 12 сут.
Глубинное культивирование – этот метод производства лимонной кислоты имеет ряд преимуществ по сравнению с методом поверхностного культивирования: эффективное использование производственных площадей, увеличение масштабности производства, механизация и автоматизация технологических процессов получения кислоты.
Однако при сравнении технологии и экономичности поверхностного и глубинного способов получения лимонной кислоты предпочтение отдают первому методу, так как при его применении себестоимость продукта и расход электроэнергии значительно ниже.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
П е р в о е з а н я т и е
1. Подготовка питательной среды.
2. Определение рН питательной среды.
3. Определение титруемой кислотности питательной среды.
4. Определение содержания углеводов в питательной среде.
5. Приготовление посевной суспензии и засев питательной среды.
6. Установка колб в термостат.
Подготовка питательной среды
Для производства лимонной кислоты оптимальное количество углерода в питательной среде - 16-17%. Составы питательных сред представлены в таблице 3.1
Компоненты питательной среды выбранного варианта поместить в колбу на 250 мл и довести объем питательной среды до 125 мл водопроводной водой. Содержимое кипятить на плитке в течение 10-15 мин, затем охладить, отлить 25 мл в мерный стакан (для исследований), а оставшуюся часть (100 мл) закрыть ватной пробкой.
Определение рН питательной среды
Определение производят с помощью иономера.
Определение титруемой кислотности питательной среды
Пипеткой отбирают 5 мл питательной среды в стакан емкостью 50 мл и разбавляют 5 мл дистиллированной воды. Добавляют 2-3 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н раствором NaOH до слабо-розового окрашивания. Если подготовленный для титрования раствор имеет окраску, мутный, в этом случае определение титруемой кислотности проводят потенциометрическим методом с использованием иономера. Для этого пипеткой отбирают 2 мл питательной среды в стакан емкостью 50 мл, добавляют 15 мл дистиллированной воды, опускают электроды и титруют 0,1 н раствором NaOH со скоростью 1-2 капли в секунду при непрерывном перемешивании.
Таблица 3.1
Варианты питательных сред
         № варианта | Источник углерода в среде Меласса сахароза Сахар,% р-р, мл % р-р, мл | Кол-во добавленной воды, мл |  Кол-во добавленных солевых растворов, мл Смешан.р-в 10% р-р 10% р-р 10% р-р 1% р-р 1% KH2PO4: 1% K2[Fe(CN)6] KH2PO4 NH4Cl ZnSO4 NH4Cl: 1% ZnSO4 1:1:1 | |||||||
| 1. | 17 | 125 | - | - | - | 0,65 | 1,5 | - | - | - |
| 2. | 8,5 | 62,5 | - | - | 62,5 | 0,32 | 0,75 | - | - | - |
| 3. | 8,5 | 62,5 | 8,5 | 10,6 | 62,5 | 0,65 | 0,75 | - | - | - |
| 4. | - | - | 8,5 | 10,6 | 125 | - | - | 1,56 | 2,3 | 0,02 |
| 5. | - | - | 17 | 21,2 | 125 | - | - | 3,1 | 4,7 | 0,04 |
Таблица 3.2
Журнал наблюдений
 № варианта | рН | Содержание сухих в-в, % | Кол-во щелочи пошедшее на титрование, мл | Масса сухого мицелия, г | Содержание лимонной кислоты | Выход лимонной к-ты, % от | Продуц. способ-ть мицелия, | ||||
| до | после | до | после | до | после |  |  Х, % С, г | потреб. сухих в-в | г/г | ||
| культивирования | культивирования | культивирования | |||||||||
Окончание титрования определяют по шкале иономера при достижении рН=7,0. Записывают количество щелочи, пошедшей на титрование (А1). Это значение понадобится для расчетов на следующем занятии.
Определение содержания сухих веществ в питательной среде
Определение проводят с помощью рефрактометра. Перед началом работы рефрактометр проверяют по дистиллированной воде, при этом пунктирная линия, нанесенная на окуляр, должна совместиться с границей света и тени на нулевой отметке шкалы, значение при этом составляет 1,333.
Затем на призмы с помощью стеклянной палочки наносят несколько капель исследуемой жидкости. Верхнюю призму опускают и плотно прижимают к нижней. После этого перемещают окуляр вдоль прорези, пока граница света и тени не совместится с пунктирной линией. По шкале прибора отмечают деление, через которое проходит граница светотени.
После определения поверхность призмы протирают фильтровальной бумагой и промывают дистиллированной водой.
Приготовление посевной суспензии и засев питательной среды
Для получения посевной суспензии в пробирку с чистой культурой гриба-продуцента вблизи пламени спиртовки наливают 9 мл стерильной воды. Бактериологической петлей осторожно соскребают слой, содержащий споры, до образования суспензии.