Методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов специальностей 270900 “Технология мяса и мясных продуктов” и 271100 “Технология молока и молочных продуктов” дневной и заочной форм (стр. 6 из 8)
Засев питательной среды производят стерильными пипетками. Из пробирки отбирают по 1 мл суспензии и количественно переносят в каждую колбу с питательной средой. Колбы закрывают ватными пробками.
Установка колб в термостат
Каждую колбу подписывают (группа, фамилия, вариант среды) и устанавливают в термостат на 7 суток при температуре 32°С.
В т о р о е з а н я т и е
1. Отделение мицелия гриба от культуральной жидкости.
2. Определение рН культуральной жидкости.
3. Определение титруемой кислотности культуральной жидкости и расчет выхода лимонной кислоты.
4. Определение содержания сухих веществ в культуральной жидкости и расчет выхода лимонной кислоты от потребленных сухих веществ.
5. Определение массы сухого мицелия и его продуцирующей способности.
Отделение биомассы гриба от культуральной жидкости
На аналитических весах взвешивают бумажный фильтр, (вес записывают) и вставляют в воронки. Колбу открывают, и содержимое фильтруют через фильтр. Отделенная от культуральной жидкости биомасса гриба является материалом для определения массы сухого мицелия. Объем культуральной жидкости (V) замеряют цилиндром и доводят до 100 мл дистиллированной водой.
Определение рН культуральной жидкости
Определение рН проводят с помощью иономера.
Определение титруемой кислотности культуральной жидкости
Определение проводят так же, как и на первом занятии. Содержание лимонной кислоты (X) вычисляют по формуле:
 X = | (A2 - A1) × P × 100 V | , (3.1) |
где Х – содержание лимонной кислоты, %; V - объем культуральной жидкости, взятый для титрования, мл (V = 5 мл при титровании с фенолфталеином, V = 2 мл при титровании с иономером); А2 - количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование культуральной жидкости, мл; А1 - количество 0,1 раствора NaOH, пошедшее на титрование питательной среды, мл; Р - фактор щелочи по лимонной кислоте (1 мл 0,1 н раствора NaOH соответствует 0,007 г лимонной кислоты).
Расчет количества синтезированной лимонной кислоты
Количество лимонной кислоты (С), синтезированной грибом, в культуральной жидкости рассчитывают по формуле:
 С = V × | Х 100 | , (3.2) |
где С – количество лимонной кислоты, г; V - объем культуральной жидкости, мл; Х - содержание лимонной кислоты, г.
Определение содержания сухих веществ в культуральной жидкости
Определение проводят с помощью рефрактометра. Количество потребленных в процессе культивирования сухих веществ (В) будет равно:
В = В1 – (В2 – С), (3.3)
где В – количество потребленных сухих веществ, %; В1 - содержание сухих веществ в питательной среде, %; В2 - содержание углеводов в культуральной жидкости, %; С – количество лимонной кислоты, г.
Выход лимонной кислоты (W) в процентах от потребляемых сухих веществ (B) рассчитывают по формуле:
 W = | C × 100 B | , (3.4) |
где W – выход лимонной кислоты, %; В - количество потребляемых в процессе культивирования сухих веществ, %; С - количество лимонной кислоты, г.
Определение массы сухого мицелия гриба и его продуцирующей способности.
Фильтры с биомассой гриба помещают в сушильный шкаф при температуре 130°С на 40 минут, сушат до постоянной массы, охлаждают в эксикаторе и взвешивают на аналитических весах. Массу сухого мицелия (Б) рассчитывают по формуле:
Б = Мм - Мф , (3.5)
где Б – масса сухого мицелия, г; Мф - масса пустого фильтра, г; Мм - масса фильтра с высушенным мицелием, г.
Продуцирующая способность мицелия (П) - это количество лимонной кислоты, синтезируемое за цикл выращивания 1 г биомассы продуцента. Bычисляют по формуле:
 П = | C Б | , (3.6) |
где П - продуцирующая способность мицелия, г/г; С - количество лимонной кислоты, г; Б - масса сухого мицелия, г.
Результаты исследований вносят в таблицу 3.2.
На основании полученных результатов делают вывод о способности гриба Aspergillus niger продуцировать лимонную кислоту и выбирают оптимальный состав среды для получения лимонной кислоты.
Контрольные вопросы
1. Какие микроорганизмы являются продуцентами лимонной кислоты?
2. В каких условиях осуществляется сверхсинтез лимонной кислоты?
3. Какими способами получают лимонную кислоту?
4. Как осуществляют поверхностное культивирование?
5. В чем сущность потенциометрического метода титрования?
Список рекомендуемой литературы
1. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология: Учеб. Пособие.- М.: Изд-во МГУ, 1989.294 с.
2. Промышленная микробиология/Под ред. Н.С. Егорова.- М.: Высш.шк.,1989.-688 с.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4
Тема: Получение белковых препаратов путем культивирования гриба Penicillium roqueforti на жидкой питательной среде.
Цель работы: Ознакомится с особенностями получения микробной биомассы на различных субстратах. Изучить способность плесневого гриба к продуцированию белка на молочной сыворотке.
Посуда, материалы, оборудование, реактивы: колбы объемом 250 мл с ватными пробками – 6; стеклянные палочки – 5; пипетки градуированные на 10 мл – 6, на 1мл – 6; цилиндры мерные на 100 мл – 6; воронки диапметром 10-15 см - 6; стеклянные стаканчики на 50 мл – 6; мерные колбы на 50 мл -6; фильтры бумажные складчатые - 6; фильтровальная бумага; плотные фильтры – 6; кобы конические на 100 мл – 6; микробюретка – 1; бюретка для титрования на 25 мл – 1; стерильные пипетки на 1 мл – 2; спиртовка, бактериологическая петля, карандаш по стеклу. Весы электронные; рефрактометр; иономер; фотоэлектроколориметр; термостат. Реактивы: молочная сыворотка, 0,1 н раствор NaOH, фенолфталеин, тимолфталеин, 1 н раствор NaOH, суспезия фосфата меди, йодит калия, крахмал, 0,01 р-р тиосульфата натрия, уксусная кислота (конц.), 2,5 % р-р сульфосалициловой кислоты, прбирки с чистой культурой Penicillium roqueforti - 2, пробирки со стерильной водой – 2.
Краткие теоретические положения
В настоящее время наиболее дефицитным компонентом пищи является белок, особенно белок высокой питательной ценности. Основным путем снижения и ликвидации этого дефицита является производство биомассы с помощью микробного синтеза. Микробиологическое производство белка не требует посевных площадей, не зависит от климатических и погодных условий, поддается точному планированию и высокому уровню автоматизации, позволяет получать продукцию стандартного качества.
Для целей микробного синтеза белка могут быть использованы те микроорганизмы, которые обладают способностью под воздействием состава питательной среды и физико-химических условий культивирования синтезировать в повышенных количествах преимущественно те соединения, которые являются целевым (основным) продуктом данного производства. Эффективность того или иного микроорганизма-продуцента для производственных целей определяется, с одной стороны, скоростью его роста, с другой - степенью использования питательных веществ. Большое значение при этом имеют также морфологические особенности продуцента (размеры клеток, способность выделяться из среды при использовании различных технологических приемов и др.).
В качестве сырья и субстратов для получения микробной биомассы в разных странах используют углеводороды или углеводсодержащее сырье. Для крупномасштабных процессов больше пригодны углеводороды: н-алканы, природный газ, как наиболее дешевое и доступное сырье. Получение белка одноклеточных возможно также на различных углеводсодержащих отходах промышленности и сельского хозяйства: мелассе, молочной сыворотке, отходах производства крахмала, гидролизатах древесины, сульфитных щелоках и для производства белковых продуктов чаще всего используют дрожжи Candida.
Углеводороды
н-Алканы – насыщенные с прямой цепью углеводороды, называют парафинами. Для получения белка используют углеводороды с длиной углеродной цепи С9 – С18, получаемые из нефти и керосина. Окислять углеводороды способны многие микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, дрожжи, микроскопические грибы. Наибольшее значение имеют аспорогенные дрожжи Candida, Rhodotorula, Torulopsis.
Метан – самый дешевый вид сырья для производства белка. Метан используют только бактерии, и их культивирование связано с рядом трудностей: взрывоопасность (метан образует с кислородом взрывоопасную смесь), низкая растворимость метана в культуральной жидкости, медленный рост микроорганизмов и их повышенная потребность в кислороде. К облигатным метанотрофам относят бактерии родов Methylobacter, Methylococcus, Methylomonas.
Углеводсодержащие субстраты
Целлюлоза. Перспективно получение биомассы микроорганизмов на ферментативных гидролизатах целлюлозосодержащего сырья - отходах деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства. Затруднением для промышленной реализации такого процесса является то, что в целлюлозосодержащем сырье имеется лигнин, затрудняющий проникновение в субстрат фермента целлюлазы. Кроме того, сырье нуждается в обработке, позволяющей понизить содержание в нем кристаллической формы целлюлозы и перевести ее в аморфное состояние, после чего ферментативный гидролиз значительно ускоряется. На большинстве гидролизных заводов внедрены продуктивные штаммы кормовых дрожжей Candida scottii и Candida tropicalis.