Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1.Какие вещества используют для разрушения клеточной оболочки?
2.От чего зависит длительность ферментации?
3.Объясните технику выделения протопластов из мезофилла листа табака.
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
4.Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
5.Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
6.Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Приложение.
Таблица 1. Среды для культивирования протопластов табака
и картофеля, рН 5,7
| Компоненты, мг/л | W-5 | K-3 | W-S-S | SH-1 | SH-2 | RMOP |
| NaCl | 9000 | |||||
| NH4NO3 | 250 | 1280 | 1650 | |||
| KNO3 | 2500 | 1900 | 1900 | 1900 | ||
| CaCl2. 2H2O | 18400 | 900 | 600 | 440 | 440 | 440 |
| MgSO4. 7H2O | 250 | 300 | 370 | 370 | 370 | |
| KH2PO4 | 170 | 170 | 170 | 170 | ||
| KCl | 800 | 300 | ||||
| NaH2PO4. H2O | 150 | |||||
| (NH4)2SO4 | 134 | |||||
| NH4Cl | 267 | 267 | ||||
| Fe-хелат | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 | |
| H3BO3 | 3 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
| MnCl2. 4H2O | 24 | 24 | 24 | 24 | ||
| ZnSO4. 7H2O | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| CuSO4. 5H2O | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | |
| CoSO4 . 7H2O | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | |
| Ki | 0,75 | 0,83 | 0,83 | 0,83 | 0,83 | |
| Na2МoO4 . 2H2O | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | |
| MnSO4. 7H2O | 14 | |||||
| Мезоинозит | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Глицин | 2 | 2 | ||||
| Никотиновая кислота | 1 | 1 | 5 | 5 | ||
| Фолиевая кислота | 0,5 | 0,5 | ||||
| Биотин | 0,05 | 0,05 | ||||
| Аденинсульфат | 40 | 80 | ||||
| Гидролизат казеина | 500 | 300 | 100 | |||
| В1 | 10 | 10 | 0,5 | 0,5 | 10 | |
| В6 | 1 | 1 | 0,5 | 0,5 | 1 | |
| НУК | 0,2 | 2 | 0,1 | |||
| ИУК | 0,1 | 0,1 | ||||
| 2,4-Д | 1 | 0,2 | ||||
| БАП | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 1 | ||
| Зеатин | 0,5 | |||||
| Сахароза | 10000 | 2500 | 2500 | 10000 | ||
| Глюкоза | 1000 | 7200 | ||||
| Ксилоза | 250 | |||||
| Маннитол | 72800 | 54600 | 34600 |
Лабораторная работа №14
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕЗОФИЛЛА ЛИСТА
Цель работы. Выделение протопластов из мезофилла листа, их культивирование на стерильных питательных средах.
Теоретическое обоснование. Растительные протопласты, высеянные на питательную среду, через три-четыре дня регенерируют клеточную оболочку и переходят к делению. К 12-14-му дню практически все клетки, начавшие делиться, превращаются в микроколонии. Состоящие из 20-40 клеток микроколонии переносят на среду для подращивания, где они превращаются в хорошо пролиферирующие каллусные ткани. Из каллусов можно получить растения-регенеранты. Сегодня выделение протопластов, их культивирование и регенерацию целых растений успешно осуществляют для видов семейства пасленовых. Если культивирование протопластов проходит успешно независимо от освещения, то для регенерации из них растений обязательно нужен свет.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Суспензия отмытых протопластов. Стерильные среды (табл.2.10). Чашки Петри диаметром 6 см, пастеровские пипетки, мерные пипетки на 1 и 10 мл, инвертированный микроскоп, камера Горяева или Фукса-Розенталя.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. В стерильных условиях пастеровской пипеткой отбирают сверху среду W-5. Осадок протопластов ресуспендируют в 0,5 мл среды К-3 (табл. 2.10). В чашку Петри наливают с помощью мерной пипетки 6-10 мл среды К-3 и туда переносят пипеткой суспензию протопластов. Перед высевом протопластов на среду К-3 для культивирования следует определить их плотность с помощью камеры Фукса-Розенталя. Оптимальная плотность высева составляет 103 клеток в 1 мл.
Культивирование протопластов проводят на рассеянном свету или в термостате при температуре 26-280С. Каждый день нужно проверять качество протопластов и контролировать их деление с помощью инвертированного микроскопа.
Через 10-20 дней культивирования протопласты образуют колонии клеток. К этому времени их можно различить глазом как светлые агрегаты. На 20-й день добавляют свежую среду. Для этого готовят несколько чашек диаметром 6-10 см со свежей средой К-3, куда пипеткой с широким концом вносят культуру протопластов.
Через три недели колонии переносят на твердую среду для регенерации из них растений. Чашки с культурой помещают на досветку. Для регенерации табака используют среду RMOP (табл.2.10). Для картофеля при культивировании протопластов используют среду W-S-S, а регенерацию осуществляют последовательно на средах SH-1 и SH-3 (табл.2.10).
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1.Когда растительные протопласты можно считать микроколонией?
2.Какова оптимальная плотность высева протопластов?
3.Какие питательные среды используют для культивирования протопластов?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.