3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
3. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Лабораторная работа №15
ИНДИВИДУАЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
ПРОТОПЛАСТОВ В МИКРОКАПЛЯХ
Цель работы. Культивирование протопластов растений в микрокаплях питательной среды.
Теоретическое обоснование. Методы разработаны в основном для массового культивирования, т.е. выращивания больших количеств клеток в общем объеме питательной среды. Между тем появляется все больше работ, где решающую роль играет индивидуальное культивирование клеток в микрообъеме среды. Такой подход применяется для культивирования гибридных продуктов, инъецированных протопластов. Культивирование небольших количеств клеток в микрообъеме питательной среды оказывается полезным при изучении их жизнедеятельности.
Протопласты и единичные клетки растений хорошо растут при определенной плотности высева. Если плотность менее 103 клеток на 1 мл среды, то происходит заметная диффузия в среду промежуточных продуктов их метаболизма, что часто приводит к гибели клеток. Обычно протопласты растений культивируют при плотности 104-105 на 1 мл, а индивидуальное культивирование протопластов проводят в микрокаплях объемом 10-100 нл.
При индивидуальном культивировании протопластов на покровное стекло наносят микрокаплю раствора сахарозы (2 моль/л) объемом 1 мкл. Затем стекло силиконизируют, а сахарозу удаляют, промывая стекло в воде. Потом наносят микрокаплю парафинового масла (1мкл), под которую вносят микрокаплю питательной среды для культивирования протопластов объемом до 100 нл. В микрокаплю питательной среды вносят один протопласт при помощи микропипетки. Обычно «рассаживают» по каплям не менее 30 протопластов в час. Выживаемость протопластов составляет до 60-90%.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Те же, что и для ведения культуры протопластов. Ламинарный бокс (установка обеспыливания УО-БГ или аналогичный; инвертированный микроскоп; манипулятор Фонбрюнна; прибор для вытягивания капилляров ПВК-1; микрокузница МЭ-4; микроаппликатор; стеклянные трубки; тефлоновый шланг; держатели капилляров из комплекта КМ-2; парафиновое или вазелиновое масло.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. При подготовке опытов особое внимание следует обратить на чистоту посуды и реактивов. Чтобы не засорить микропипетку, все среды желательно профильтровать и тем самым удалить мелкие частички. Для соблюдения стерильности работы нужно проводить в ламинарном боксе, куда помещается вся установка. Сначала выполняют подготовительные операции.
Выделение протопластов проводится по стандартным методикам.
Изготовление микропипеток: на микрокузнице МЭ-4 тонкостенные капилляры диаметром 1,5 мм вытягивают до диаметра около 100 мкм на приборе ПВК-1. Кончик микропипетки изгибают.
Приготовление масла: парафиновое или вазелиновое масло заливают в делительной воронке деионизированной водой в соотношении 1:1. Воронку встряхивают до получения тонкой эмульсии и оставляют в вертикальном положении для отстаивания. Воду, собравшуюся внизу, сливают. Процедуру выполняют пять раз. Затем масло центрифугируют для удаления мельчайших капелек воды (120 мин при 20 тыс. об/мин на роторе SW-27). Масло отбирают, стерилизуют 2 ч при 1200С. После охлаждения в масло стерильно добавляют 0,1-0,2 объема среды для культивирования протопластов. Сосуд с маслом и средой встряхивают для получения суспензии. После отстаивания можно добавить 1-2% стерильного активированного угля. Приготовленое таким образом масло можно хранить в холодильнике при 40С в течение месяца.
Подготовка камеры для индивидуального культивирования: чашку Петри перед опытом заполняют приготовленным масло на 3-4 мм высоты. В чашку вносят каплю среды для культивирования и каплю суспензии протопластов. Объем капель не должен превышать 100 мкл, чтобы они не выступали над поверхностью масла. Камеру закрепляют в препаратоводителе инвертированного микроскопа.
Затем переходят к основным операциям. Стерильная пипетка устанавливается в держатель из комплекта КМ-2, закрепленный на головке манипулятора Фонбрюнна. Держатель и примыкающую часть микропипетки протирают 70%-ным этиловым спиртом. Микропипетку вводят в поле зрения микроскопа. Затем заполняют микропипетку маслом из камеры, а попавший при этом в шланги воздух стравливают через краник.
После этого в микропипетку набирают 10-20 мкл среды из капли под маслом и при помощи микроаппликатора или шприца на 20 мкл на дно камеры вносят микрокапли. Объем микрокапель определяют по формуле для объема полусферы
V= 2\3 п R3
где R – радиус микрокапли, а V – ее объем. Так, для капли объемом 10 нл диаметр равен 342 мкм. Чтобы придать микрокаплям форму полусферы, лишнюю среду отсасывают микропипеткой.
Рассаживание протопластов по каплям выполняют следующим образом. Передвигая масляную камеру при помощи препаратоводителя, приподнятую микропипетку вводят в каплю с суспензией протопластов. Микропипетку размещают над выбранным протопластом, обдувают его средой и засасывают, используя микроаппликатор или шприц на 20 мкл. Для ускорения работы можно набирать в микропипетку до 10 протопластов. После этого микропипетку приподнимают и выводят из капли с суспензией.
При помощи препаратоводителя в поле зрения микроскопа вводят микрокаплю, размещают над ней микропипетку с протопластом и опускают ее до соприкосновения с мениском. С помощью микроаппликатора протопласт выпускают в микрокаплю и отбирают из нее избыток среды. Все вышеописанные операции выполняются при 100-кратном увеличении.
Примерно раз в неделю микроколониям нужно менять среду. Для этого микропипетку заполняют маслом, как описано выше; в камеру вносят каплю свежей среды ( если ее состав отличается от используемой вначале). Часть старой среды из микрокапель забирают в микропипетку и сливают в каплю со старой средой или в каплю с суспензией. Затем микропипетку заполняют свежей средой и доливают микрокапли.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1. В чём заключается индивидуальное культивирование клеток?
2.Какова выживаемость протопластов при культивировании в микрокаплях?
3.Как происходит рассаживание протопластов по каплям?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
4. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
5. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
6. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Литература
Основная:
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
4. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
39. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
40. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
7. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
8. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.Н., Прокофьев М.И.. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., ВО Агропромиздат, 1990.
9. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М., Наука, 1983.
10. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев, Наукова думка, 1984.
11. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М., Наука, 1988.
12. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев, Наукова думка, 1990.
Дополнительная:
7. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений.М., Наука, 1991.
8. Культура клеток растений и биотехнология. М., Наука, 1986.
3. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В, Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
4.Биотехнология сельскохозяйственных растений. М., ВО Агропромиздат, 1987
5.Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез: дифференциация в культуре клеток растений. Тимир. чтения, М., Москва, 1975.
6.Валиханова Г.Ж.., Есмагулов К.Е. Русско-казахский словарь терминов, используемых в биотехнологии растений. Алматы, Іазає университетi,1997.
7. Рахимбаев И.Р., Колумбаева С.Ж., Джокебаева С.А. Культура клеток и клеточная инженерия растений. Алматы, КазГУ, 1993.
8. Полимбетова Ф.А., Сарсенбаев Б.А. Русско-казахский толковый словарь терминов по физиологии и биотехнологии растений. Алматы, “Сјздiк-Словарь”, 1999.
9. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М., Мир, 1987.
10.Биотехнология. Принципы и применение. М., Мир, 1988.
Лабораторная работа №8
КАЛЛУСНАЯ КУЛЬТУРА