Суспензия представляет собой одиночные клетки и агрегаты, которые растут в жидкой питательной среде определенного состава в стерильных условиях. Существуют разные способы культивирования суспензии: в колбах на качалках, ферментерах. Необходимое условие роста суспензии состоит в перемешивании или встряхивании среды, что обеспечивает аэрацию культур. Обычно суспензию получают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, но без агара. Растительные суспензии характеризуют по следующим показателям: количество жизнеспособных клеток, сегрегированность суспензии и плотность клеток в суспензионной культуре.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Каллусы. Колбы с жидкой питательной средой. Пинцеты, скальпели, стерильные чашки Петри, спиртовка, спички.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Открывают чашку Петри с каллусом, стерильным пинцетом выкладывают кусочки рыхлого каллуса в стерильную чашку Петри, отбирают светлые участки и опускают их в колбочки со стерильной средой для суспензии. Расчет навески каллуса на объем жидкости делается следующим образом: 3-5 г каллуса на 100 мл жидкости. Объем суспензии составляет 10-20% объема колбы. Например, в колбу объемом 500 мл наливают 50-100 мл суспензии. Закрывают колбу ватно-марлевой пробкой с целлофаном или фольгой и ставят на качалку на три-четыре недели (оптимальная длительность одного пассажа).
Контрольные вопросы.
1.Что представляет собой суспензионная культура?
2.Какие вещества можно синтезировать в культуре клеток?
3.Каковы условия роста суспензии?
Лабораторная работа №11
ПОДСЧЕТ ПЛОТНОСТИ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЕ
Цель работы. Подсчёт плотности клеток в суспензионной культуре в счётной камере Фукса-Розенталя под микроскопом.
Теоретическое обоснование. Одним из основных показателей, характеризующих суспензию, служит плотность клеточной популяции. Число клеток определяют после мацерации (разделения клеток) суспензии. Подсчет клеток ведется в счетной камере под микроскопом. В качестве мацерирующего вещества применяется 10-20%-ная хромовая кислота, которая гидролизует средние пластинки, соединяющие клетки. После мацерации для лучшего отделения клеток друг от друга их надо несколько раз пропустить через шприц с толстой иглой. Затем клетки считают. После добавления к суспензии хромовой кислоты смесь ставят в термостат при температуре 60С на 10-30 мин. Время нагревания зависит от особенностей суспензии (агрегированности, химического состава клеточных стенок и т.д.). Обычно различают три фазы ростового цикла суспензии: лаг-фазу (2-3 сут), фазу экспоненциального роста (2-10 сут) и стационарную фазу (10-15 сут). Хорошо растущая суспензия имеет S-образную кривую роста. Длительность цикла роста определяется временем до выхода культуры в стационарную фазу. Продолжительность фаз зависит от вида растения и органа, из которого получена, из которого получена культура каллуса, а затем суспензия, от начального количества клеток (первичного инокулята), от условий выращивания. Обычно длительность пассажа (время до пересадки) составляет 14-16 дней. При этом плотность возрастает от 5.104-105 кл/мл до 106-5.106 кл/мл (примерно в 20 раз). Для субкультивирования (пересадки) суспензия берется в конце экспоненциальной фазы. Для каждой культуры надо подбирать условия, при которых рост суспензии оптимален: реализуется S-образная кривая при высокой (70-80%) жизнеспособности.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Колбочка с суспензией. 20-% хромовая кислота. Стерильные пипетки с отрезанным кончиком, резиновая груша, пеницилиновые пузырьки, пипетка с оттянутым носиком, камера Фукса-Розенталя (гемоцитоиетр), камера для подсчета элементов крови, микроскоп, покровные стекла, шприц с толстой иглой.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Отбирают пипеткой со срезанным кончиком несколько миллилитров суспензии, предварительно взболтав суспензию в колбе. Для построения ростовой кривой используют по 20 мл суспензии из трех колбочек. Их сливают в одну емкость и все операции проделывают из смешанной суспензии. К одному объему исследуемой суспензии добавляют два объема хромовой кислоты и ставят при 600С на 10 мин. Затем пропускают смесь через шприц с большой иглой три раза, при этом клетки хорошо отделяются друг от друга.
Камеру Фукса-Розенталя и покровное стекло тщательно промывают, высушивают. Притирают покровное стекло к камере до появления колец Ньютона. Пипеткой с узким носиком набирают мацерированный раствор и подносят к краю покровного стекла, при этом жидкость заполняет весь объем камеры. Подсчитывают клетки под микроскопом, в четырех больших квадратах по диагонали или по всей камере. При каждом заполнении считают верхнюю и нижнюю сетки. Операцию подсчета выполняют три-четыре раза. Для получения достоверных данных считают до 1000 клеток.
Для построения S-образной кривой показатели снимают через день в процессе культивирования. Плотность суспензии подсчитывают по формуле:
х = М . n .1000 / 3,2,
где х – число клеток в 1мл, М – среднее число клеток в камере, n — разведение.
Контрольные вопросы
1.Что служит одним из основных показателей, характеризующих суспензию?
2.Каковы фазы ростового цикла суспензии?
3.Каким образом ведут подсчёт плотности суспензии?
Лабораторная работа №12
ВЫСЕВ СУСПЕНЗИИ
НА ТВЕРДУЮ АГАРИЗОВАННУЮ СРЕДУ
(МЕТОД ПЛЕЙТИНГА)
Цель работы. Культивирование клеточной суспензии на твёрдой питательной среде с двойным содержанием агара.
Теоретическое обоснование. Для проведения клеточной селекции обычно применяют высев мелкоагрегированной суспензии в агаризованную среду. При этом одиночные клетки и мелкие агрегаты дают начало клеточным клонам. Конечная цель клеточной селекции-получение растений из клеточных клонов.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Суспензия, среда для высева суспензии с двойным содержанием агара (1,2-1,4%). Стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Суспензию наливают в стерильный цилиндр и дают ей отстояться в течение 5 мин. Отбирают пипеткой 5 мл верхней фракции суспензии (обогащенной одиночными клетками) и смешивают в чистом стерильном цилиндре с 5 мл теплой питательной среды для роста каллуса. Быстро разливают содержимое цилиндра в чашки Петри, дают застыть и закрывают парафилмом. Через три-пять недель подсчитывают колонии диаметром более 1 мм. Эффективность высева определяется отношением количества образовавшихся колоний к количеству высеянных клеток и выражается в процентах. Обычно плотность высева составляет 105 кл/мл. Она не должна быть очень высокой, чтобы растущие колонии не сливались. Через три недели подсчитывают количество колоний в каждой чашке.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1.Какие суспензии применяют для проведения клеточной селекции?
2.Какова конечная цель клеточной селекции?
3.В чём заключается метод Плейтинга?
Лабораторная работа №13
ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ:ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ
И ФЕРМЕНТАЦИЯ ТКАНЕЙ
Цель работы. Выделение протопластов из молодых листьев с испольованием ферментных смесей на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ.
Теоретическое обоснование. Клеточные оболочки у растений представлены главным образом целлюлозой, гемицеллюлозой и пектиновыми веществами. Поэтому для разрушения оболочки используют ферментные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом. Для ферментации используют молодые листья, предварительно осажденную суспензионную культуру или каллусные ткани, растущие на агаре.
Длительность ферментации зависит от типа ткани, состава ферментных растворов, температуры инкубации. Ферментацию следует контролировать визуально, используя инвертированный микроскоп. В связи с этим ферментацию лучше проводить в чашках Петри. Если ферментацию выполняют в течение ночи, то следует использовать менее концентрированные смеси, если в течение рабочего дня-более концентрированные. Рассмотрим технику выделения протопластов из мезофилла листа табака.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Асептические растения. Стерильные среды (табл.1), ферменты. Чашки Петри диаметром 10 см, колбы на 50 мл, пастеровские пипетки, колбочки со стеклянными воронками и нейлоновыми фильтрами с диаметром пор 60 мкм, мерные пипетки на 1 и 10 мл, центрифужные пробирки на 10 мл, шприц с насадкой для фильтров «Миллипор» и фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, пинцеты, скальпели, настольная центрифуга, инвертированный микроскоп.