Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. За сутки до опыта готовят ферментный раствор для выделения протопластов из мезофилла листа. Ферментная смесь содержит 0,5%-ную целлюлозу, 0,5%-ную мацеразу, 0,2%-ную дреселлазу, которую растворяют в растворе сахарозы (0,5 моль/л) и CaCl2 (50 ммоль/л), рН 5,5-5,6. Приготовленный раствор центрифугируют для осаждения нерастворимых частиц в течение 10-15 мин при 1,5-2 g. После доведения рН до 5,5-5,6 раствор при помощи шприца с насадкой фильтруют через фильтр «Миллипор» в чашки Петри по 7-10 мл в каждую.
Молодые листья табака от растений, выращенных в асептических условиях, переносят в стерильные чашки Петри и нарезают узкими полосками или елочкой. Затем листья сразу помещают на поверхность ферментного раствора. Чашки переносят в термостат при 28-300С на 15-18 ч. Для 1 г ткани достаточно 10 мл ферментного раствора. Контроль за ферментацией осуществляют с использованием инвертированного микроскопа. Аналогичным об
разом можно провести ферментацию из растений любых видов, но при этом следует изменить состав раствора. Так, для выделения протопластов из мезофилла картофеля применяют смесь, состоящую из 1%-ного целлюлазина, 0,5%-ной мацеразы и 0,1%-ной дреселлазы. После ферментации содержимое чашки фильтруют через нейлоновый фильтр в пустую стерильную колбу. Затем пипеткой суспензию, содержащую протопласты, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 3 мин при 1g. Протопласты всплывают на поверхность. Их отбирают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, заполненную до половины средой W-5 (табл.2.10). Протопласты центрифугируют в этой среде 2мин при 700 g, для того чтобы отмыть от остатков ферментной смеси. Отмывку проводят дважды. При центрифугировании в питательной среде W-5 протопласты осаждаются. Это последний этап в процессе их выделения. В некоторых случаях рекомендуют центрифугирование смеси в градиенте сахарозы, тогда протопласты формируют кольцо на поверхности среды. Отбирают их также пастеровской пипеткой.
Контрольные вопросы.
1.Какие вещества используют для разрушения клеточной оболочки?
2.От чего зависит длительность ферментации?
3.Объясните технику выделения протопластов из мезофилла листа табака.
Таблица 1. Среды для культивирования протопластов табака
и картофеля, рН 5,7
| Компоненты, мг/л | W-5 | K-3 | W-S-S | SH-1 | SH-2 | RMOP |
| NaCl | 9000 | |||||
| NH4NO3 | 250 | 1280 | 1650 | |||
| KNO3 | 2500 | 1900 | 1900 | 1900 | ||
| CaCl2. 2H2O | 18400 | 900 | 600 | 440 | 440 | 440 |
| MgSO4. 7H2O | 250 | 300 | 370 | 370 | 370 | |
| KH2PO4 | 170 | 170 | 170 | 170 | ||
| KCl | 800 | 300 | ||||
| NaH2PO4. H2O | 150 | |||||
| (NH4)2SO4 | 134 | |||||
| NH4Cl | 267 | 267 | ||||
| Fe-хелат | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 | |
| H3BO3 | 3 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
| MnCl2. 4H2O | 24 | 24 | 24 | 24 | ||
| ZnSO4. 7H2O | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| CuSO4. 5H2O | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | |
| CoSO4 . 7H2O | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | |
| Ki | 0,75 | 0,83 | 0,83 | 0,83 | 0,83 | |
| Na2МoO4 . 2H2O | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | |
| MnSO4. 7H2O | 14 | |||||
| Мезоинозит | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Глицин | 2 | 2 | ||||
| Никотиновая кислота | 1 | 1 | 5 | 5 | ||
| Фолиевая кислота | 0,5 | 0,5 | ||||
| Биотин | 0,05 | 0,05 | ||||
| Аденинсульфат | 40 | 80 | ||||
| Гидролизат казеина | 500 | 300 | 100 | |||
| В1 | 10 | 10 | 0,5 | 0,5 | 10 | |
| В6 | 1 | 1 | 0,5 | 0,5 | 1 | |
| НУК | 0,2 | 2 | 0,1 | |||
| ИУК | 0,1 | 0,1 | ||||
| 2,4-Д | 1 | 0,2 | ||||
| БАП | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 1 | ||
| Зеатин | 0,5 | |||||
| Сахароза | 10000 | 2500 | 2500 | 10000 | ||
| Глюкоза | 1000 | 7200 | ||||
| Ксилоза | 250 | |||||
| Маннитол | 72800 | 54600 | 34600 |
Лабораторная работа №14
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕЗОФИЛЛА ЛИСТА
Цель работы. Выделение протопластов из мезофилла листа, их культивирование на стерильных питательных средах.
Теоретическое обоснование. Растительные протопласты, высеянные на питательную среду, через три-четыре дня регенерируют клеточную оболочку и переходят к делению. К 12-14-му дню практически все клетки, начавшие делиться, превращаются в микроколонии. Состоящие из 20-40 клеток микроколонии переносят на среду для подращивания, где они превращаются в хорошо пролиферирующие каллусные ткани. Из каллусов можно получить растения-регенеранты. Сегодня выделение протопластов, их культивирование и регенерацию целых растений успешно осуществляют для видов семейства пасленовых. Если культивирование протопластов проходит успешно независимо от освещения, то для регенерации из них растений обязательно нужен свет.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Суспензия отмытых протопластов. Стерильные среды (табл.2.10). Чашки Петри диаметром 6 см, пастеровские пипетки, мерные пипетки на 1 и 10 мл, инвертированный микроскоп, камера Горяева или Фукса-Розенталя.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. В стерильных условиях пастеровской пипеткой отбирают сверху среду W-5. Осадок протопластов ресуспендируют в 0,5 мл среды К-3 (табл. 2.10). В чашку Петри наливают с помощью мерной пипетки 6-10 мл среды К-3 и туда переносят пипеткой суспензию протопластов. Перед высевом протопластов на среду К-3 для культивирования следует определить их плотность с помощью камеры Фукса-Розенталя. Оптимальная плотность высева составляет 103 клеток в 1 мл.
Культивирование протопластов проводят на рассеянном свету или в термостате при температуре 26-280С. Каждый день нужно проверять качество протопластов и контролировать их деление с помощью инвертированного микроскопа.
Через 10-20 дней культивирования протопласты образуют колонии клеток. К этому времени их можно различить глазом как светлые агрегаты. На 20-й день добавляют свежую среду. Для этого готовят несколько чашек диаметром 6-10 см со свежей средой К-3, куда пипеткой с широким концом вносят культуру протопластов.
Через три недели колонии переносят на твердую среду для регенерации из них растений. Чашки с культурой помещают на досветку. Для регенерации табака используют среду RMOP (табл.2.10). Для картофеля при культивировании протопластов используют среду W-S-S, а регенерацию осуществляют последовательно на средах SH-1 и SH-3 (табл.2.10).