Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701 «Биотехнология» очной формы обучения (стр. 2 из 15)

Суспензия представляет собой одиночные клетки и агрегаты, которые растут в жидкой питательной среде определенного состава в стерильных условиях. Существуют разные способы культивирования суспензии: в колбах на качалках, ферментерах. Необходимое условие роста суспензии состоит в перемешивании или встряхивании среды, что обеспечивает аэрацию культур. Обычно суспензию получают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, но без агара. Растительные суспензии характеризуют по следующим показателям: количество жизнеспособных клеток, сегрегированность суспензии и плотность клеток в суспензионной культуре.

Одним из основных показателей, характеризующих суспензию, служит плотность клеточной популяции. Число клеток определяют после мацерации (разделения клеток) суспензии. Подсчет клеток ведется в счетной камере под микроскопом.

Для проведения клеточной селекции обычно применяют высев мелкоагрегированной суспензии в агаризованную среду. При этом одиночные клетки и мелкие агрегаты дают начало клеточным клонам. Конечная цель клеточной селекции-получение растений из клеточных клонов.

Клеточные оболочки у растений представлены главным образом целлюлозой, гемицеллюлозой и пектиновыми веществами. Поэтому для разрушения оболочки используют ферментные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом. Для ферментации используют молодые листья, предварительно осажденную суспензионную культуру или каллусные ткани, растущие на агаре. Длительность ферментации зависит от типа ткани, состава ферментных растворов, температуры инкубации.

Растительные протопласты, высеянные на питательную среду, через три-четыре дня регенерируют клеточную оболочку и переходят к делению. К 12-14-му дню практически все клетки, начавшие делиться, превращаются в микроколонии. Сосотоящие из 20-40 клеток микроколонии переносят на среду для подращивания, где они превращаются в хорошо пролиферирующие каллусные ткани. Из каллусов можно получить растения-регенеранты.

Культивирование небольших количеств клеток в микрообъеме питательной среды оказывается полезным при изучении их жизнедеятельности.

Протопласты и единичные клетки растений хорошо растут при определенной плотности высева. Если плотность менее 10³ клеток на 1 мл среды, то происходит заметная диффузия в среду промежуточных продуктов их метаболизма, что часто приводит к гибели клеток. Обычно протопласты растений культивируют при плотности 10⁴-10⁵ на 1 мл, а индивидуальное культивирование протопластов проводят в микрокаплях объемом 10-100 нл.

Оборудование и техническое оснащение лабораторных работ

Семена, клубни, побеги и стебли растений, культура каллусной ткани

Стаканы химические, колбы с дистиллированной водой, чашки Петри, предметные стекла, скальпель, пинцет, иглы, пинцеты, стерильные скальпели, марлевые мешочки, стерилизаторы, пробирки, чашки с питательными средами, фильтры Зейца или «Миллипор» для холодной стерилизации, вата, 96%-ный спирт, 0,1%-ный раствор сулемы или диацид, стерильная вода.

Автоклав, сушильный шкаф.

Требования к порядку выполнения лабораторных работ

Лабораторная работа проводится строго в лаборатории, в белых халатах, с соблюдением техники безопасности.

Лабораторная работа выполняется строго по порядку, определённому методикой ведения работы.

Требования к отчету по лабораторным работам

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, таблиц или в графическом виде (при необходимости зарисовывать результат).

Контрольные вопросы

1. Что такое стерильность?
2. Какими способами стерилизуют посуду, инструменты?
3. Какими способами стерилизуют растительные объекты?
4. Каков состав питательных сред?
5. Какие вещества используют в качестве ауксинов в питательных средах?
6. Что такое маточные растворы и как их готовят?
7. Какова цель выращивания стерильных проростков?
8. Каковы возможные пути использования стерильных проростков?
9. Какие среды используют для выращивания стерильных проростков?
10. Какие части растения используют для ускоренного размножения?
11. С какой целью из растений вычленяют апикальные меристемы?
12. Какими способами пользуются в работе во избежание подсыхания питательных сред?
13. Назовите наиболее распространённый способ размножения картофеля.
14. На чём основывается действие размножения черенкованием?
15. При каком условии в культуре in vitro у черенков картофеля можно индуцировать появление клубней?
16. Каким образом высокое содержание кинетина в среде влияет на процесс культивирования земляники?
17. Каким способом можно индуцировать корнеобразование при микроразмножении земляники?
18. В каких растворах и с какой целью промывают марлевые мешочки с почками?
19. Каким способом можно индуцировать корнеобразование при микроразмножении земляники?
20. Что происходит при культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде, содержащей цитокинин?
21. При каких условиях проводят корнеобразование проростков при микроклональном размножении земляники?
22. В чём заключается сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса?
23. Что представляет собой каллус?
24. Из каких органов на искусственных питательных средах могут образоваться каллусы?
25. От чего зависят переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани?
26. Что происходит с каллусной тканью люцерны при пересадке ее на среду, содержащую 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП)?
27. Что нужно предпринять, если наблюдается нарушение нормального развития растений?
28. Что представляет собой суспензионная культура?
29. Какие вещества можно синтезировать в культуре клеток?
30. Каковы условия роста суспензии?
31. Что служит одним из основных показателей, характеризующих суспензию?
32. Каковы фазы ростового цикла суспензии?
33. Каким образом ведут подсчёт плотности суспензии?
34. Какие суспензии применяют для проведения клеточной селекции?
35. Какова конечная цель клеточной селекции?
36. В чём заключается метод Плейтинга?
37. Какие вещества используют для разрушения клеточной оболочки?
38. От чего зависит длительность ферментации?
39. Объясните технику выделения протопластов из мезофилла листа табака.
40. Когда растительные протопласты можно считать микроколонией?
41. Какова оптимальная плотность высева протопластов?
42. Какие питательные среды используют для культивирования протопластов?
43. В чём заключается индивидуальное культивирование клеток?
44. Какова выживаемость протопластов при культивировании в микрокаплях?
45. Как происходит рассаживание протопласьов по каплям?

Лабораторная работа №1

МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО

МАТЕРИАЛА, ПОСУДЫ,

ИНСТРУМЕНТОВ И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Цель работы. Стерилизация помещений, растительного материала, посуды, инструментов и питательных сред.

Теоретическое обоснование. Одно из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов состоит в соблюдении строгой стерильности. Тщательная стерилизация необходима, так как на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования растительных тканей и клеток хорошо развиваются и микроорганизмы, что создает опасность для культивируемого материала. В результате жизнедеятельности организмов изменяется состав питательных сред. Кроме того, изолированные от растения ткани, клетки и особенно протопласты легко повреждаются микроорганизмами. Поэтому все опыты с культурой изолированных органов, тканей, клеток и протопластов растений проводят в ламинар-боксах. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы, необходимые для работы.

Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Семена, клубни, побеги и стебли растений.

Стаканы химические на 500-700 мл, колба с дистиллированной водой на 1 л, чашки Петри, предметные стекла, скальпель, пинцет, игла, марлевые мешочки, стерилизаторы, пробирки, чашки с питательными средами, фильтры Зейца или «Миллипор» для холодной стерилизации.

Автоклав, сушильный шкаф.

Содержание и порядок выполнения лабораторной работы

Ламинар-бокс. Протирают внутреннюю рабочую поверхность ламинара 70%-ным спиртом. Затем размещают в ламинаре спиртовую горелку, спички, стакан с96%-ным спиртом, стерильную посуду и инструменты, колбу со стерильной водой. При проведении работ по вычленению меристем в ламинар ставят бинокулярную лупу. Ламинар-бокс облучают бакткрицидными ультрафиолетовыми лампами в течение 10-12 ч.