Посуда. Стерилизация проводится в сушильном шкафу или в автоклаве. Перед стерилизацией посуду надо вымыть и высушить. Для мытья посуды используют детергенты, а также раствор двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпик). Перед стерилизацией пробирки, колбы предварительно закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу. Затем посуду помещают в сушильный шкаф и нагревают при температуре +175оС в течение 2 ч (после того как установится нужная температура). При таком нагревании погибают не только бактерии, но и их споры. Температуру в сушильном шкафу выше 175оС допускать не следует, так как при этом ватные пробирки буреют, а бумага, которой закрывают ватную пробку сверху, становится ломкой.
Еще более строгой стерилизации можно добиться под давлением в автоклаве, так как влажный жар эффективнее убивает микроорганизмы и их споры, чем сухой. Автоклавированию подвергают стаканы с крышками, чашки Петри, пипетки, колбы с дистиллированной водой. Посуду заворачивают в фольгу или оберточную бумагу и автоклавируют при 2 атм. В течение 25-30 минут. Верхнюю часть градуированных пипеток закрывают ватной прокладкой, пипетки заворачивают в бкмагу по 10 штук.
Инструменты. Предварительную стерилизацию инструментов скальпелей, пинцетов, игл и т.д. проводят нагреванием сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 12 ч при 140оС. Кипячением удобно стерилизовать шприцы. Металлические предметы нельзя стерилизовать автоклавированием, так как под действием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе посадки инструменты стерилизуют дополнительно, помещая в фарфоровый стакан с 96%-ным этиловым спиртом и обжигая в пламени спиртовки. Обжигать можно ланцеты, пинцеты, микробиологические петли. После стерилизации обжиганием каждый инструмент помещают между листами предварительно простерилизованной плотной бумаги, сложенными в пачку или в специальный штатив. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции. Затем его следует снова простерилизовать спиртом и обжечь. Очень тонкие инструменты (иглы, кусочки лезвий) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт.
Материалы. Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки, которые могут использоваться при посадке тканей, стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. В течение 25-30 мин.
Растительный материал. Для стерилизации семян, верхушечных меристем, кусочков ткани, выделенных из различных частей растения, применяют различные стерилизующие растворы: водные растворы сулемы, или двуххлористой ртути (0,1%), брома (1%), пергидроля (20-30%), хлорамина (3-6%), диацида, гипохлорита натрия (10%).
Диацид готовят следующим образом: растворяют отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридинилхлорида в горячей воде (около 300 мл), смешивают полученные растворы, доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1 л и добавляют несколько капель детергента Твин-80. Диацид хранят в холодильнике в плотно закрытой колбе в темноте.
Прежде чем приступить к стерилизации растительной ткани, ее предварительно очищают. Корнеплоды, клубни, толстые стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, снимают кожуру (у корней и клубнеплодов), кору (у побегов), промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд в абсолютный спирт. При этом кроме действия спирта отмечается усиление эффекта основного стерилизующего раствора. После стерилизации растительные объекты следует тщательно отмыть от стерилизующих веществ, многократно последовательно ополаскивая дистиллированной водой.
Диацид рекомендуется использовать при стерилизации семян кукурузы, пшеницы, ржи; пергидроль для фасоли, люпина, подсолнечника (с очищенной кожурой), томатов, редиса и др. Время стерилизации семян диацидом 15-20 мин, пергидролем 10 мин. Некоторые семена (хлопчатник, горох) хорошо стерилизуются концентрированной серной кислотой в течении 3 мин, с последующей пятикратной промывкой автоклавированной дистиллированной водой. Время стерилизации меристем и кусочков тканей из разных частей растения примерно вдвое меньше. Обычно используют диацид, который затем отмывают водой, воду меняют 5-6 раз.
Иногда семена некоторых растений: помидор, яблони, тыквы, бобов и табака, не обрабатывают антисептиком. Ко времени созревания семена оказываются заключенными в мясистые, деревянистые или костянковидные покровы. Здоровые с неповрежденной поверхностью плоды этих культур тщательно промывают мыльной водой, затем несколько раз спиртом. После этого в строго асептических условиях их разламывают. Стерильным инструментом из разлома выбирают семена и помещают их в стерильную посуду.
Питательные среды. Колбы и пробирки с питательными средами закрывают ватными пробками, завертывают горлышко в целлофан или оберточную бумагу и автоклавируют при температуре 120оС и давлении 1 атм. В течение 20 мин.
Холодная стерилизация. Органические жидкости, которые не выносят нагревания, освобождают от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм.
Требования к отчету по лабораторной работе.
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы
1. Что такое стерильность?
2. Какими способами стерилизуют посуду, инструменты?
3. Какими способами стерилизуют растительные объекты?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
Лабораторная работа № 2
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Цель работы. Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей на примере среды Мурасиге-Скуга
Теоретическое обоснование. Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, определенные аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, повышающие доступность железа для клеток в широких пределах рН.
Углеводы выступают необходимым компонентом питательных сред при культивировании изолированных клеток и тканей, так как они не способны к автотрофному питанию. Обычно в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20-40 г/л. Опухолевые ткани, в которых много активных гидролитических ферментов, могут расти на средах с растворенным крахмалом.
Регуляторы роста необходимы для дифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление дедифференцированных клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза можно снизить содержание ауксинов в среде или исключить их из питательной среды. На средах без гормонов растут опухолевые и «привыкшие» к таким условиям ткани. Автономность по отношению к гормонам того и другого типа или к одному из них связана со способностью клеток синтезировать гормоны.
В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции образования каллуса обычно применяют высокие концентрации ауксинов, а при последующих пересадках ткань может расти, если содержание ауксинов в среде уменьшено в несколько раз.
В качестве источника цитокининов в искусственных питательных смесях используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин (0,001-10 мг/л). Зеатин и БАП более активны в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза, чем кинетин. В состав некоторых питательных смесей входит аденин.
Отдельные питательные среды включают кроме ауксинов и цитокининов гибберелловую кислоту (ГК). Иногда к питательной среде добавляют растительные экстракты или соки. Наибольшей ростактивирующей способностью обладает кокосовое молоко-жидкий эндосперм кокосового ореха.
Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар-полисахарид, получаемый из морских водорослей. Наименьшее количество нежелательных примесей содержат бактериальный агар «Difco» и бактериальный агар отечественного производства, их можно применять без предварительной промывки. Обычно для получения твердой питательной смеси к среде добавляют 5-8% агара.
Растворы макросолей, микросолей и витаминов удобно готовить концентрированными. Маточные растворы хранят в холодильнике, витамины при отрицательной температуре. В 10-20 раз более концентрированными, чем нужно, готовят растворы макросолей, в 100-1000 раз более концентрированными-растворы микросолей, в 1000 раз-растворы витаминов.