Для культивирования клеток, тканей и органов тех или иных растенийиспользуют питательные среды различного состава. Наиболее широко применяются среда Мурасиге-Скуга (табл.1, 2), среда Уайта (табл.2.3), среда Гамборга, или В-5 (табл.2.4).
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Химреактивы (табл.1). Колбы или стаканы химические на 1л, банки с притертыми пробками для хранения маточных растворов на 1л и 100мл, баночки на 20-50мл, мерные пипетки на 10 и 1мл, весы технические, весы торзионные, электроплитка.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Приготовить питательную среду Мурасиге и Скуга (табл.1, 2) для культивирования растительных органов и тканей.
Прежде всего необходимо приготовить маточные растворы макро-, микросолей и витаминов. Для среды Мурасиге и Скуга обычно готовят маточные растворы следующего состава: 1) NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4 .7H2O (MgSO4. 7H2O вливают последним без нагревания, что предотвращает выпадение осадка); 2) раствор CaCl2 ; 3) раствор хелата железа (раствор FeSO4 и ЭДТА-Na2, необходимый для образования хелата железа, следует нагреть до кипения); 4) раствор микроэлементов.
Количество солей, необходимое для приготовления маточных растворов, а также количество маточного раствора, которое надо взять для приготовления питательной среды, приведены в табл. 2.2.
Полученные растворы сливают в склянки с притертой пробкой, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Хелат железа хранят в темной склянке.
Концентрированные растворы витаминов (каждого в отдельности) хранят во флакончиках. Для приготовления растворов берут десятикратную по отношению к добавляемой дозе навеску витамина и растворяют в 10 мл воды. В 1 мл этого раствора содержится порция витамина, необходимая для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга.
Теперь, используя маточные растворы, надо приготовить питательные среды для культивирования органов и тканей растений. В химический стакан или колбу емкостью 1л помещают навеску сахарозы 30 г, доливают до половины дистиллированную воду, нагревают, после растворения сахарозы добавляют необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей (см. табл. 2.2.), витаминов и доводят объем до 1л дистиллированной водой.
Растворы фитогормонов готовят следующим образом.
Ауксины ( 2,4-Д, -НУК, ИУК, индолил-масляная кислота – ИМК): 100 мг вещества растворяют в 0,5-2 мл спирта, подогревают, добавляют дистиллированную воду до 100 мл (концентрация 1 мг/мл).
Цитокинины (кинетин, зеатин, БАП): растворяют в небольшом объеме 0,5 н. HCl, подогревают, добавляют соответствующий объем дистиллированной воды.
Абсцизовая кислота (АБК): навеску растворяют в 70%-ном этаноле, доводя до нужного объема.
Гиббереллиновая кислота (ГК): навеску растворяют в воде.
При введении фитогормонов в среду перед автоклавированием следует обязательно довести рН среды до 5,5-5,6. Однако следует учитывать, что после автоклавирования изменяется первоначальный состав термолабильных компонентов среды. Так, тиамин распадается на пиримидин и тиазол, а кинетин и ИУК теряют часть своей активности. В связи с этим витамины и особенно термолабильные фитогормоны стерилизуют фильтрованием, пропуская через фильтр Зейца или «Миллипор» с диаметром пор 0,4 мкм (НУК, ИУК, зеатин, БАП). В этом случае для регуляции рН среды используют стерильные растворы щелочи.
Агар-агар предварительно замачивают в воде для набухания. Затем его нагревают на электроплитке при помешивании до полного растворения. После этого раствор агара надо слить с раствором солей, витаминов и сахарозы и довести объем среды до 1л. Колбы со средой закрывают ватной пробкой, бумагой или фольгой и стерилизуют в автоклаве.
Питательные среды разливают в пробирки (1/3 объема), которые закрывают ватными пробками или фольгой, стерилизуют в автоклаве.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1. Каков состав питательных сред для изолированных клеток и тканей?
2. Какие вещества используют в качестве ауксинов в питательных средах?
3. Что такое маточные растворы и как их готовят?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
6. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
7. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
8. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Приложение.
Таблица 1. Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| NH4NO3 | 1650 | Fe2SO4 7H2O | 27,8 |
| KNO3 | 1900 | Na2-ЭДТА 2H2O | 37,3 |
| CaCl2. 2H2O | 440 | Тиамин - HCl | 0,1 |
| MgSO4. 4H2O | 370 | Пиридоксин - HCl | 0,5 |
| KH2PO4 | 170 | Никотиновая кислота | 0,5 |
| MnSO4. 4H2O | 22,3 | Мезо-инозит | 100 |
| CoCl2 . 6H2O | 0,025 | Глицерин | 2,0 |
| ZnSO4. 7H2O | 8,6 | ИУК | 2,0 |
| CuSO4. 5H2O | 0,025 | Кинетин | 0,2 |
| Na2MoO4. 2H2O | 0,25 | Сахароза | 30.000 |
| Kl | 0,83 |
Таблица 2. Состав маточных растворов по Мурасиге и Скугу
| Компоненты питательной среды Примечание Макросоли, г/л маточного раствора КNO3 38 CaCl2 (безводный) 8,8 NH4NO3 33 или CaCl2. 2H2O 13,8 MgSO4 (безводный) 3,6 или MgSO4.7H2O 7,4 KH2PO4 3,4 На 1 л среды брать по 50мл маточного раствора Микросоли, мг/100 мл маточного раствора H3PO4 620 MnSO4. 4H2O 2230 ZnSO4 860 Kl 83 Na2MoCl4. 2H2O 25 CuSO4. 5H2O 2,5 CoCl2. 6H2O 2,5 На 1 л среды брать по 1 мл маточного раствора Fe-хелат, мг/100 мл маточного раствора FeSO4.7H2O 557 ЭДТА-Na2 (трилон Б) 745 На 1 л среды брать по 5 мл маточного раствора |
Лабораторная работа №3
ВЫРАЩИВАНИЕ СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ
Цель работы. Выращивание стерильных проростков гороха, сои с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro
Теоретическое обоснование. Стерильные проростки выращивают с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro. В зависимости от задачи опыта семена высевают на воду или агаризованную питательную среду.
Существуют три возможных пути использования стерильных проростков: 1) для получения эксплантов из дифференцированных тканей, которые при переносе на питательную среду, содержащую фитогормоны, дифференцируются и в результате интенсивной пролиферации образуют каллусную ткань; 2) для получения каллуса непосредственно на проростках; 3) для получения протопластов из частей проростка, обычно из листьев, иногда из корней.
Для образования каллуса на проростках необходимы фитогормоны, поэтому в состав питательной среды для выращивания входит 2,4-Д.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Семена (горох, соя). Диацид, 96%-ный спирт, стерильные химические стаканы, стерильная вода.
Стерильные чашки Петри, пробирки, пинцет, стерильные марлевые мешочки.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Отобрать здоровые ровные семена гороха или сои, тщательно промыть их в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Промытые семена в марлевых мешочках погрузить на 2-5 мин в 96%-ный спирт, промыть в стерильной воде и поместить в раствор диацида на 20 мин. Затем пятикратно ополоснуть семена в стерильной воде.
Работу проводят в ламинар-боксе. С помощью стерильного пинцета разложить по 5-10 семян в стерильные чашки Петри или пробирки с питательной средой. Чашки Петри с семенами помещают в термокомнату при температуре +25оС. Асептические проростки можно использовать для получения эксплантов через 8-15 дней.
Для проращивания семян можно использовать среды Уайта (табл.1), Мурасиге и Скуга (МС) (лаб.раб 2) или Гамборга (В-5) (табл. 2), но без добавок фитогормонов.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками