Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Используют культуру апикальных меристем земляники в возрасте трех-четырех недель после начала культивирования. В стерильных условиях извлекают из пробирки конгломерат почек земляники. Освобождают основание конгломерата от остатков агаризованной питательной среды, промывают его в стерильной воде и переносят в стерильную чашку Петри. Разъединяют с помощью скальпеля конгломерат на отдельные почки и каждую из них переносят пинцетом в пробирки с питательной средой для укоренения (табл. 2). Обжигают горлышко пробирки и пробку, закрывают пробкой, оборачивают целлофаном и помещают пробирки в световую камеру с освещенностью 10 000 люкс, температурой +26оС и влажностью 60%.
Через месяц после пересадки почек на среду для корнеобразования проростки можно переводить в нестерильные условия. Обычно растения пересаживают в ящики или горшки, наполненные смесью торфа и песка (3:1), первое время накрывают колпаком из полиэтилена.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы
1.Каким способом можно индуцировать корнеобразование при микроразмножении земляники?
2. Что происходит при культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде, содержащей цитокинин?
3.При каких условиях проводят корнеобразование проростков при микроклональном размножении земляники?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
21. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
22. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
23. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Приложение.
Таблица 1. Питательная среда для корнеобр
азования при микроклональном размножении земляники, рН 5,6-5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| Макросоли | По Уайту | Никотиновая кислота | 0,5 |
| Микросоли | По Хеллеру | ИУК | 0,5 |
| Цитрат железа | 3,5 | Сахароза | 20000 |
| Аскорбиновая кислота | 1,0 | Агар-агар | 7000 |
| Тиамин | 0,5 | Пиридоксин | 0,5 |
Таблица 2. Среда для укоренения
растений картофеля, рН 5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л |
| Минеральные элементы | По Мурасиге-Скугу |
| Тиамин | 1,0 |
| Пиридоксин | 0,5 |
| Сахароза | 5000 |
| ИМК | 0,1 |
| Агар | 7000 |
Лабораторная работа №8
КАЛЛУСНАЯ КУЛЬТУРА
Цель работы. Получение каллусной ткани из сердцевины стебля взрослого растения табака в условиях in vitro.
Теоретическое обоснование. Сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса заключается в том, что выделенный кусочек ткани (эксплант) стерилизуют и переносят на искусственную питательную среду, содержащие минеральные соли, органические вещества, фитогормоны. На такой питательной среде клетки начинают делиться. Различно дифференцированные клетки претерпевают in vitro дедифференциацию и переходят к делению, образуя первичный каллус. Возникший на эксплантах каллус через четыре-шесть недель переносят на свежую питательную среду (субкультивируют). Техника культивирования тканей позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Каллус-это неорганизованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллуса контролируются фитогормонами группы ауксинов и цитокининов.
Каллусы на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, легко образуются на эксплантах из самых различных органов: из асептически прорастающих семян, отрезков стеблей и корней, изолированных фрагментов паренхимы, тканей клубня, изолированной сердцевины стебля, из листа, зародышей и др.
В качестве примера рассмотрим метод получения каллусной ткани из сердцевины стебля взрослого растения табака.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Взрослые растения табака. Химический стакан с дистиллированной водой, конические колбы на 100 мл со стерильной питательной средой Мурасиге и Скуга. Вата, 96%-ный спирт, 0,1%-ный раствор сулемы или диацид, стаканы со стерильной водой, стерильные марлевые мешочки, стерильный пробкобур, стерильный скальпель, стерильная чашка Петри.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Из стеблей табака в фазе бутонизации или цветения вырезают участки с хорошо развитой, но еще не одревесневевшей сердцевиной (второе-третье междоузлие). Выбранные участки стебля разрезают на части длиной 5 см и моют в мыльном растворе щеткой, затем отмывают от мыла водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Чистые участки стебля помещают в стакан с дистиллированной водой и переносят в ламинар.
Для стерилизации протирают стебли табака 96%-ным спиртом, и погружают в марлевых мешочках в 0,1%-ный водный раствор сулемы на 10-15 мин или в раствор диацида (1:1000) на 25 мин. После стерилизации стебли промывают в пяти порциях дистиллированной воды, оставляя в каждой на 5 мин. Затем из центральной части стебля вырезают стерильным сверлом для пробок (диаметр 5 мм) столбик сердцевиной ткани и помещают в стерильную чашку Петри. Стерильным скальпелем удаляют участки ткани вблизи прежних срезов (концевые участки). Вырезанная сердцевина не должна содержать элементов флоэмы и камбия. Полученные цилиндрики сердцевины разрезают скальпелем в чашке Петри на кусочки длиной 2-3 мм и помещают на поверхность агаровой среды. Посуду с эксплантами табака помещают в термостат (в темноту) при температуре +25оС для культивирования. Через три недели анализируют результаты по образованию каллуса. Таким же образом получают каллус из корнеплодов картофеля и моркови.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1. В чём заключается сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса?
2.Что представляет собой каллус?
3.Из каких органов на искусственных питательных средах могут образоваться каллусы?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
24. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
25. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
26. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Лабораторная работа №9
СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ
В КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ
Цель работы. Регенерация растения люцерны in vitro на примере соматического эмбриогенеза на стерильной питательной среде Гамборга (В-5).
Теоретическое обоснование. Регенерацию in vitro рассмотрим на примере соматического эмбриогенеза у люцерны. Переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани зависят от соотношения гормонов в питательной среде. Преобладание цитокининов над ауксинами приводит к индукции стеблевого органогенеза или к соматическому эмбриогенезу. Преобладание ауксинов над цитокининами способствует образованию корней в каллусной ткани-корневому органогенезу.
В каллусной ткани люцерны при пересадке ее на среду, содержащую 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), индуцируется образование почек и эмбриоидов. Через две-три недели от начала действия индуктора морфогенеза на каллусах развиваются зеленые почки и эмбриоиды длиной 0,5-2,0 мм. Их образованию предшествует возникновение на светлой поверхности каллусов зеленых точек, которые появляются через несколько дней после пересадки. Эмбриоиды в основном образуются у тетраплоидных сортов и у гибридов люцерны, почки чаще формируются у диплоидных форм. Иногда почки и эмбриоиды могут развиваться одновременно на одном каллусе.