Для получения растений-регенерантов возникшие почки и эмбриоиды помещают на среду без гормонов, где через две-три недели формируются растения. Иногда наблюдается нарушение нормального развития растений (образование каллуса, преимущественное развитие корня и побега, утолщение различных органов). В этом случае материал следует пересадить на среду без гормонов, с уменьшенной вдвое концентрацией всех компонентов. Срок, необходимый для прохождения всех стадий регенерации растений из тканевых культур (от листового экспланта до регенеранта), составляет около двух месяцев.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Культура каллусной ткани, полученной из листа люцерны. Колбы на 50 мл со стерильной питательной средой В-5 (табл.2.4). Стерильная чашка Петри, стерильные скальпели.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Соблюдая стерильность, каллус переносят в чашку Петри, разделяют на кусочки размерами 5х5 мм и помещают на новую питательную среду В-5 с добавкой 6-БАП (0,2 мг/л). Эта среда стимулирует развитие в каллусной ткани клеток меристематического и эмбрионального типа, из которых в дальнейшем формируются почки и эмбриоиды. Пересаженные каллусы ставят для инкубации в световые камеры (16 ч освещения). Через три недели наблюдают развитие зеленых почек и эмбриоидов. Полученные эмбриоиды и почки используют для получения растений-регенерантов. Их переносят с соблюдением строгой стерильности на питательную агаризованную среду В-5 без гормонов и инкубируют в световой камере. В одну колбу на 50 мл с 25 мл среды следует высаживать четыре-шесть почек эмбриоидов. Через три недели отмечают образование побегов из почек и формирование растений-регенерантов. На одном экспланте может появиться до нескольких десятков побегов. Когда побеги достигают высоты 10 мм, их следует разделить и перенести на среду для укоренения: В-5 с добавлением нафтилуксусной кислоты (НУК) концентрацией 0,1 мг/л. Через 5-10 дней отмечают появление корней.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1. От чего зависят переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани?
2.Что происходит с каллусной тканью люцерны при пересадке ее на среду, содержащую 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП)?
3.Что нужно предпринять, если наблюдается нарушение нормального развития растений?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
27. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
28. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
29. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Лабораторная работа №10
СУСПЕНЗИОННАЯ КУЛЬТУРА.
ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ
ИЗ КАЛЛУСА
Цель работы. Получение суспензионной культуры из каллуса в жидкой питательной среде в стерильных условиях.
Теоретическое обоснование. Клеточная суспензия – источник ценных биологически активных веществ, служит исходным материалом для клеточной селекции. Суспензионная культура может быть использована как модельная система для изучения путей вторичного метаболизма, синтеза ферментов, экспрессии генов.
Получение экономически важных веществ растительного происхождения в пробирочной культуре связано со способностью культивируемых клеток многих растений синтезировать различного рода продукты, которые обычно получают из целых растений. При этом появляется возможность создавать принципиально новые продукты, превосходящие традиционные. Клеточные культуры – продуценты имеют определенные преимущества перед традиционным растительным сырьем, так как продукт можно получать независимо от ареала распространения растения, сезона, погоды, почвенных условий.
Культура клеток позволяет оптимизировать и стандартизировать условия выращивания и, следовательно, автоматизировать технологический процесс. Если к тому же учесть быстрое истощение естественных сырьевых ресурсов, то преимущества использования клеточных технологий становятся очевидными.
В культуре клеток могут синтезироваться специфические для высших растений экономически важные соединения: алкалоиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, терпеноиды и терпены, эфирные масла, стероиды, пряности, инсектициды, натуральные красители и многие другие ценные вещества (6). Так у нас в стране налажено промышленное производство биомассы ценного лекарственного растения женьшеня. Из 0,1 г экспланта женьшеня за 1,5 месяца культивирования in vitro получают до 5 г ткани. Средний прирост корня женьшеня в оптимальных условиях на плантациях за год достигает лишь 8 г. Следовательно, культивирование in vitro, несомненно, является рентабельным производством. По качеству экстракты, полученные из каллусной ткани, почти не отличаются от экстрактов из натурального корня женьшеня.
Суспензия представляет собой одиночные клетки и агрегаты, которые растут в жидкой питательной среде определенного состава в стерильных условиях. Существуют разные способы культивирования суспензии: в колбах на качалках, ферментерах. Необходимое условие роста суспензии состоит в перемешивании или встряхивании среды, что обеспечивает аэрацию культур. Обычно суспензию получают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, но без агара. Растительные суспензии характеризуют по следующим показателям: количество жизнеспособных клеток, сегрегированность суспензии и плотность клеток в суспензионной культуре.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Каллусы. Колбы с жидкой питательной средой. Пинцеты, скальпели, стерильные чашки Петри, спиртовка, спички.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Открывают чашку Петри с каллусом, стерильным пинцетом выкладывают кусочки рыхлого каллуса в стерильную чашку Петри, отбирают светлые участки и опускают их в колбочки со стерильной средой для суспензии. Расчет навески каллуса на объем жидкости делается следующим образом: 3-5 г каллуса на 100 мл жидкости. Объем суспензии составляет 10-20% объема колбы. Например, в колбу объемом 500 мл наливают 50-100 мл суспензии. Закрывают колбу ватно-марлевой пробкой с целлофаном или фольгой и ставят на качалку на три-четыре недели (оптимальная длительность одного пассажа).
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1.Что представляет собой суспензионная культура?
2.Какие вещества можно синтезировать в культуре клеток?
3.Каковы условия роста суспензии?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
30. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
31. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
32. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Лабораторная работа №11
ПОДСЧЕТ ПЛОТНОСТИ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИОННОЙ
КУЛЬТУРЕ
Цель работы. Подсчёт плотности клеток в суспензионной культуре в счётной камере Фукса-Розенталя под микроскопом.
Теоретическое обоснование. Одним из основных показателей, характеризующих суспензию, служит плотность клеточной популяции. Число клеток определяют после мацерации (разделения клеток) суспензии. Подсчет клеток ведется в счетной камере под микроскопом. В качестве мацерирующего вещества применяется 10-20%-ная хромовая кислота, которая гидролизует средние пластинки, соединяющие клетки. После мацерации для лучшего отделения клеток друг от друга их надо несколько раз пропустить через шприц с толстой иглой. Затем клетки считают. После добавления к суспензии хромовой кислоты смесь ставят в термостат при температуре 60С на 10-30 мин. Время нагревания зависит от особенностей суспензии (агрегированности, химического состава клеточных стенок и т.д.). Обычно различают три фазы ростового цикла суспензии: лаг-фазу (2-3 сут), фазу экспоненциального роста (2-10 сут) и стационарную фазу (10-15 сут). Хорошо растущая суспензия имеет S-образную кривую роста. Длительность цикла роста определяется временем до выхода культуры в стационарную фазу. Продолжительность фаз зависит от вида растения и органа, из которого получена, из которого получена культура каллуса, а затем суспензия, от начального количества клеток (первичного инокулята), от условий выращивания. Обычно длительность пассажа (время до пересадки) составляет 14-16 дней. При этом плотность возрастает от 5.104-105 кл/мл до 106-5.106 кл/мл (примерно в 20 раз). Для субкультивирования (пересадки) суспензия берется в конце экспоненциальной фазы. Для каждой культуры надо подбирать условия, при которых рост суспензии оптимален: реализуется S-образная кривая при высокой (70-80%) жизнеспособности.