Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Колбочка с суспензией. 20-% хромовая кислота. Стерильные пипетки с отрезанным кончиком, резиновая груша, пеницилиновые пузырьки, пипетка с оттянутым носиком, камера Фукса-Розенталя (гемоцитоиетр), камера для подсчета элементов крови, микроскоп, покровные стекла, шприц с толстой иглой.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Отбирают пипеткой со срезанным кончиком несколько миллилитров суспензии, предварительно взболтав суспензию в колбе. Для построения ростовой кривой используют по 20 мл суспензии из трех колбочек. Их сливают в одну емкость и все операции проделывают из смешанной суспензии. К одному объему исследуемой суспензии добавляют два объема хромовой кислоты и ставят при 600С на 10 мин. Затем пропускают смесь через шприц с большой иглой три раза, при этом клетки хорошо отделяются друг от друга.
Камеру Фукса-Розенталя и покровное стекло тщательно промывают, высушивают. Притирают покровное стекло к камере до появления колец Ньютона. Пипеткой с узким носиком набирают мацерированный раствор и подносят к краю покровного стекла, при этом жидкость заполняет весь объем камеры. Подсчитывают клетки под микроскопом, в четырех больших квадратах по диагонали или по всей камере. При каждом заполнении считают верхнюю и нижнюю сетки. Операцию подсчета выполняют три-четыре раза. Для получения достоверных данных считают до 1000 клеток.
Для построения S-образной кривой показатели снимают через день в процессе культивирования. Плотность суспензии подсчитывают по формуле:
х = М . n .1000 / 3,2,
где х – число клеток в 1мл, М – среднее число клеток в камере, n — разведение.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы
1.Что служит одним из основных показателей, характеризующих суспензию?
2.Каковы фазы ростового цикла суспензии?
3.Каким образом ведут подсчёт плотности суспензии?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
33. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
34. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
35. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Лабораторная работа №12
ВЫСЕВ СУСПЕНЗИИ
НА ТВЕРДУЮ АГАРИЗОВАННУЮ СРЕДУ
(МЕТОД ПЛЕЙТИНГА)
Цель работы. Культивирование клеточной суспензии на твёрдой питательной среде с двойным содержанием агара.
Теоретическое обоснование. Для проведения клеточной селекции обычно применяют высев мелкоагрегированной суспензии в агаризованную среду. При этом одиночные клетки и мелкие агрегаты дают начало клеточным клонам. Конечная цель клеточной селекции-получение растений из клеточных клонов.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Суспензия, среда для высева суспензии с двойным содержанием агара (1,2-1,4%). Стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Суспензию наливают в стерильный цилиндр и дают ей отстояться в течение 5 мин. Отбирают пипеткой 5 мл верхней фракции суспензии (обогащенной одиночными клетками) и смешивают в чистом стерильном цилиндре с 5 мл теплой питательной среды для роста каллуса. Быстро разливают содержимое цилиндра в чашки Петри, дают застыть и закрывают парафилмом. Через три-пять недель подсчитывают колонии диаметром более 1 мм. Эффективность высева определяется отношением количества образовавшихся колоний к количеству высеянных клеток и выражается в процентах. Обычно плотность высева составляет 105 кл/мл. Она не должна быть очень высокой, чтобы растущие колонии не сливались. Через три недели подсчитывают количество колоний в каждой чашке.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1.Какие суспензии применяют для проведения клеточной селекции?
2.Какова конечная цель клеточной селекции?
3.В чём заключается метод Плейтинга?
Литература
1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.
2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.
3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.
36. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.
37. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.
38. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.
Лабораторная работа №13
ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ:
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ
И ФЕРМЕНТАЦИЯ ТКАНЕЙ
Цель работы. Выделение протопластов из молодых листьев с испольованием ферментных смесей на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ.
Теоретическое обоснование. Клеточные оболочки у растений представлены главным образом целлюлозой, гемицеллюлозой и пектиновыми веществами. Поэтому для разрушения оболочки используют ферментные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом. Для ферментации используют молодые листья, предварительно осажденную суспензионную культуру или каллусные ткани, растущие на агаре.
Длительность ферментации зависит от типа ткани, состава ферментных растворов, температуры инкубации. Ферментацию следует контролировать визуально, используя инвертированный микроскоп. В связи с этим ферментацию лучше проводить в чашках Петри. Если ферментацию выполняют в течение ночи, то следует использовать менее концентрированные смеси, если в течение рабочего дня-более концентрированные. Рассмотрим технику выделения протопластов из мезофилла листа табака.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Асептические растения. Стерильные среды (табл.1), ферменты. Чашки Петри диаметром 10 см, колбы на 50 мл, пастеровские пипетки, колбочки со стеклянными воронками и нейлоновыми фильтрами с диаметром пор 60 мкм, мерные пипетки на 1 и 10 мл, центрифужные пробирки на 10 мл, шприц с насадкой для фильтров «Миллипор» и фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, пинцеты, скальпели, настольная центрифуга, инвертированный микроскоп.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. За сутки до опыта готовят ферментный раствор для выделения протопластов из мезофилла листа. Ферментная смесь содержит 0,5%-ную целлюлозу, 0,5%-ную мацеразу, 0,2%-ную дреселлазу, которую растворяют в растворе сахарозы (0,5 моль/л) и CaCl2 (50 ммоль/л), рН 5,5-5,6. Приготовленный раствор центрифугируют для осаждения нерастворимых частиц в течение 10-15 мин при 1,5-2 g. После доведения рН до 5,5-5,6 раствор при помощи шприца с насадкой фильтруют через фильтр «Миллипор» в чашки Петри по 7-10 мл в каждую.
Молодые листья табака от растений, выращенных в асептических условиях, переносят в стерильные чашки Петри и нарезают узкими полосками или елочкой. Затем листья сразу помещают на поверхность ферментного раствора. Чашки переносят в термостат при 28-300С на 15-18 ч. Для 1 г ткани достаточно 10 мл ферментного раствора. Контроль за ферментацией осуществляют с использованием инвертированного микроскопа. Аналогичным об
разом можно провести ферментацию из растений любых видов, но при этом следует изменить состав раствора. Так, для выделения протопластов из мезофилла картофеля применяют смесь, состоящую из 1%-ного целлюлазина, 0,5%-ной мацеразы и 0,1%-ной дреселлазы. После ферментации содержимое чашки фильтруют через нейлоновый фильтр в пустую стерильную колбу. Затем пипеткой суспензию, содержащую протопласты, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 3 мин при 1g. Протопласты всплывают на поверхность. Их отбирают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, заполненную до половины средой W-5 (табл.2.10). Протопласты центрифугируют в этой среде 2мин при 700 g, для того чтобы отмыть от остатков ферментной смеси. Отмывку проводят дважды. При центрифугировании в питательной среде W-5 протопласты осаждаются. Это последний этап в процессе их выделения. В некоторых случаях рекомендуют центрифугирование смеси в градиенте сахарозы, тогда протопласты формируют кольцо на поверхности среды. Отбирают их также пастеровской пипеткой.