Культура тканей и её использование человеком (стр. 2 из 3)
Стерильность культуры
Для успешного выращивания клеток требуется идеальная стерильность как самих выращиваемых клеток, так и питательной среды, в которой клетки содержатся.
Также для нормального роста питательный раствор надо периодически очищать от продуктов жизнедеятельности клеток (в том числе и токсичных) и от отмерших клеток.
Лимит делений клеток
Со временем у всех живых клеток на земле (кроме организмов одноклеточных и раковых опухолей, ), кончается “запас возможных делений”, что приводит к прекращению возможности клеток делиться и воспроизводить себе подобных. В природе это ведет к скорой гибели организма, в пробирке - абсолютно аналогично. Может быть, после прекращения возможности делиться клетка проживет еще весьма немалый срок, но для успешного увеличения количества клеток это совершенно бесполезно.
Чаще всего в лабораториях исчерпавшие свой “лимит делений” клетки отделяют от остальной клеточной культуры. Такие клетки для культивирования тканей чаще всего не нужны. Однако, если заранее известно, что культуру не собираются перевивать, скорее всего такие клетки оставят.
Фактором, определяющим лимит деления клеток, является фермент теломераза, а точнее отсутствие активности этого фермента. Фермент теломеразы отвечает за восстановление нормальной длинны молекулы ДНК после клеточного деления (митоза). Например, фермент теломераза “отключен” у всех живых клеток многоклеточных организмов, за исключением раковых опухолей, которым этот фермент не нужен, т.к. опухолевые клетки проскакивают период интерфазы (см. рисунок 1), делясь с большей скоростью.
В настоящее время учеными получена серия линий клеток, имеющих искусственно активированный ген теломераза. В отличии от опухолевых клеток, у которых этот ген активировался путем случайной мутации, у этих линий клеток он активирован специально.
Рис. 1. Схема основных этапов размножения клеток.
Точность концентрации веществ в питательной среде
Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др.
Размер сосуда
С течением времени культура увеличивается в размерах до такой степени, что начинает уже касаться стенок сосуда. В этот момент можно пронаблюдать очень интересный процесс: клетки, касаясь стенок, начинают замедлять жизнедеятельность и теряют сверхважную функцию - способность делиться. На данный момент считается, что причиной этому служат определенные ферменты, сосредоточенные в клетке.
По сути своей, этот процесс для разведения клеток просто ужасен, однако именно благодаря этому процессу можно понять причину ограничения роста живых существ. Клетки “в пробирке” как-будто помнят, как надо себя вести в организме. Скорее всего, именно эти ферменты не позволяют нам увеличиваться до невероятных размеров!
Дифференцировка
Дифференцировка - процесс обретения клеткой определенной функции, задачи. Так какбд у каждой дифференцированной клетки есть узкая специализация, ограничивающая ее возможности, то клетка при этом теряет возможность делиться! А это обозначает полнейшую бесполезность этой клетки для культивирования.
Процесс разделения функций у клеток идет следующим образом. Сначала клетка делится (митозом) и получается две совершенно одинаковых клетки. Далее, только одна из новообразовавшихся клеток начинает обретать определенную функцию. Например, клетки крови образуются из красного костного мозга. При этом одна из образовавшихся клеток становится клеткой крови, а другая остается клеткой красного костного мозга.
Цели культивирования, способы их достижения и возможные проблемы.
Для разных целей требуются разные “типы” клеток. Например, для синтеза двух разных органов одному организму потребуются разные типы исходных клеток.
Сравнивая эти типы клеток сразу найдется целый ряд отличий. Можно было бы предположить, что у разных органов разные функции, поэтому они и различаются. Так и есть. Однако, напрашивается вопрос: как и почему одна клетка становится например нейроном, а другая частью мышечной ткани?
Объяснение этому процессу лежит внутри клетки. Основным фактором разделения клеток служат определенные градиенты. Градиентами чаще всего служат иРНК (информационная/матричная РНК).
Градиент - закономерное изменение морфологических или функциональных свойств по одному из признаков на любой стадии его развития.
Разумеется, при выращивании даже самых простых биологических материалов возникает целый ряд трудностей, зачастую весьма дорогостоящих, что приводит к нерентабельному производству, что в свою очередь снижает объемы продукции, поэтому перед учеными стоит очень важный вопрос: как снизить себестоимость выпускаемой продукции, будь то вирусная культура (например, вакцина), или будь то искусственный орган для имплантации.
На сегодняшний день известны несколько клеточных культур, выращивание которых наиболее просто и наименее дорого:
1. В первую очередь, это опухолевые клетки. У них нет лимита делений, у них наибольшая скорость деления, у них нет интерфазы и т.д.
> Опухолевые клетки можно использовать в качестве чистого материала для исследования воздействия лекарственных препаратов на вирус возбудитель. Также облученные линии опухолевых клеток вводят в тело больного в процессе лечения, считается, что воздействие облученных определенным образом клеток способно нести эффект опухолевых антигенов.
2. Также, помимо опухолевых клеток, есть и другие типы клеток, способные жить почти бесконечно долго. А именно клетки почки собаки (MDCK) и фибропласты (3T3).
3. Далее идут клетки, поддающиеся культивации, однако с наибольшими затратами: клетки кости и хряща, мышечные клетки, эпителиальные клетки, нервные клетки, эндокринные клетки.
Как было сказано ранее, у опухолевых клеток есть ряд особенностей, обуславливающих успешный рост культуры, однако некоторые аналогичные функции можно встретить и у других клеток. Поэтому возникает вопрос: “Какую культуру выбрать: опухолевую или нормальную?
Преимущества типов клеток
| Нормальная клетка | Опухолевая клетка |
| В основном культуры с ограниченным временем жизни | Большинство линий клеток бессмертны |
| Полиферация ограничена размерами посуды | Абсолютно неограниченная пролиферация клеток |
> Пролиферация - процесс увеличения размера ткани путем увеличения количества клеток.
Разумеется, для выращивания разных видов и типов клеток требуются разные условия. Например, питательные среды:
> Для определения типа питательной среды нужно определить два фактора: тип культуры и планируемые исследования.
1. При выращивании культуры нейронов, мышечных клеток и некоторых эпителиальных клеток пластиковая поверхность покрывается желатином или коллагеном для придания ей положительного заряда.
2. Почти повсеместное распространение получил полистирол, обработанный таким образом, чтобы увеличить смачиваемость и придать поверхности отрицательный заряд.
Также немаловажное значение имеет посуда, в которой выращиваются клетки:
Главными факторами выбора посуды являются: требуемое количество клеток, требуемое количество слоев, порядок отбора образцов:
1. Чашки Петри довольно дешевы, удобны для окрашивания и сепарации клеток, однако весьма велик шанс заражения культуры и требуется особая концентрация веществ в воздухе.
2. Флаконы дороже Чашек Петри, зато герметичны, что не требует поддержания особого состава воздуха.
3. Также возможный параметр подбора посуды - объем планируемой культуры.
Транспортировка
При самостоятельной покупке клеточной культуры стоит помнить, что длительная транспортировка клеток происходит в замороженном состоянии, а именно в жидком азоте.
При перемещении культуры клетки могут легко повредиться, а также стоит постоянно поддерживать водный и воздушный баланс. Также не стоит перемещать культуру в не до конца заполненном клетками сосуде. В общем, перемещение культуры в не замороженном состоянии возможно только на совсем небольшие расстояния.
Проблемы при использовании метода:
Одной из главных проблем, с которой сталкивается метод культуры тканей - это материальная проблема. Процесс выращивания клеточных культур крайне сложен, дорогостоящ и трудоемок.
Помимо этого, при использовании любого метода по замене органов и тканей имеется риск в “неудачности” операции. Когда-то пациентам сообщили, что если вероятность успеха, однако они слепо верят в эту вероятность, совершенно не думая о плачевности неудачной операции.
Одной из решаемых проблем является неоднородность белков у пациента и клеточной культуры, что проявлялось в отторжении органа. Как уже сказано, объясняется это тем, что организм реципиента отвечает на трансплантат иммунологической реакцией. Эта реакция направлена на защиту от биологически инородных тел. Именно поэтому против любых чужеродных белков, в том числе против белков трансплантата, образуются антитела. Поиски путей преодоления тканевой несовместимости ведутся в следующих направлениях: