Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...10
1.1. Систематика сусликов рода Spermophilus в классических зоологических исследованиях...10
Род Суслики -Spermophilus F. Cuvier, 1825 (=Ci(e!Ius Oken, 1816)...13
Подрод Настоящие суслики - Citelhis Oken, 1816...17
Подрод Пустынно-степные суслики - Colobofis Brandt, 1843...23
1.2.Спорные вопросы систематики изучаемых видов сусликов рода
Spermophilus...29
1.2.1 .Крапчатый суслик Spermophilus suslicus Guldenstaedt, 1770...29
1.2.2. Малый Spermophiluspygmaeus Pallas, 1778 и горный S. miisicus Menetrie, 1832 суслики...32
1.2.3. Желтый суслик Spermophilusfulvus Lichtenstein, 1823...34
1.2.4. Большой суслик Spermophilus major Pallas, 1778...34
1.2.5. Краснощекий суслик Spermophilus erythrogenys Brandt, 1841...36
1.3. Генетические исследования сусликов рода Spermophilus...38
1.3.1. Использование цитогенетических методов в систематике и филогении сусликов...39
1.3.2. Аллозимные исследования сусликов...42
1.3.3. Иммуннологические исследования сусликов...43
1.3.4. Молекулярные исследования и филогения сусликов...44
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ...47
2.1. Сведения об использованном материале...47
2.2. Кариологический анализ...52
2.2.1. Приготовление хромосомных препаратов...52
2.2.2. Кариотипирование...53
2.2.3. Рутинное окрашивание хромосом...54
2.2.4. Дифференциальное окрашивание хромосом для выявления структурного гетерохроматина (С- окраска)...54
2.2.5. Дифференциальное окрашивание ядрышкообразующих районов
хромосом (NOR-o краска)...55
2.3. Молекулярно-генетический анализ...55
3
2.3.1. Выделение ДНК...56
2.3.2. Электрофорез в агарозном геле нативной ДНК...56
2.3.3. Условия проведения RAPD-PCR реакции...57
2.3.4. RAPD-PCR-анализ...60
2.3.5. Описание генетического разнообразия...62
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...64
3.1. Цитогенетическая характеристика сусликов рода Spermophilus...64
3.1.1. Кариологическое исследование сусликов подрода Citellus...64
3.1.1.1. Различия хромосомных наборов двух близких видов сусликов Spermophilus pygmaeus и S. musicus...64
3.1.1.2. Цитогенетические различия двух хромосомных форм крапчатого
суслика Spermophilus suslicus...66
3.1.2. Кариологическое исследование сусликов подрода Colobotis...70
3.1.2.1. Цитогенетические различия краснощекого суслика
Spermophilus erythrogenys...70
ЗА.2.2. Цитогенетическая характеристика большого суслика
Spermophilus major...75
3.2. Генетическое разнообразие и филогенетические взаимоотношения сусликов рода Spermophilus по данным RAPD-PCR-анализа...76
3.2.1. Молекулярная дифференциация и филогения сусликов
рода Spermophilus...76
3.2.2. Генетическое разнообразие и филогенетические связи сусликов
подрода Citellus...88
3.2.3. Генетическое разнообразие и филогенетические связи сусликов
подрода Colobotis...96
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ...106
4.1. Генетическая дифференциация сусликов рода Spermophilus...106
4.1.1. Цитогенетическая и молекулярная дифференциация сусликов подрода
Citellus...106
4.1.2. Цитогенетическая и молекулярная дифференциация сусликов подрода
Colobotis...112
4.2. Молекулярная дивергенция и филогенетические связи в двух группах (подроды Citellus и Colobotis) палеарктических сусликов рода Spermophilus...118
4.3. Особенности формообразования у видов сусликов с различной пространственной структурой ареалов...121
4
4.4. Естественная гибридизация алло- и парапатрических видов сусликов рода Spermophilus...123
4.5. Таксономическая интерпретация полученных результатов...125
ЗАКЛЮЧЕНИЕ...128
ВЫВОДЫ...130
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...131
ПРИЛОЖЕНИЕ...150
Введение
5 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Широкое применение цитогенетических методов исследования позволило выявить большое разнообразие внутривидовой кариотипической изменчивости во многих группах. Только за последние несколько десятков лет у ряда видов млекопитающих, в том числе и у сусликов рода Spemophilus, обнаружены внутривидовые хромосомные формы. Эти формы эволюционно молоды, часто географически обособлены и, по определению одного из основоположников теории хромосомного видообразования Н.Н. Воронцова (1999), каждая из них может быть "кандидатом в новый вид". Однако их таксономический ранг зачастую невозможно установить традиционными зоологическими методами вследствие высокого морфологического сходства. Решить многие спорные таксономические вопросы позволяют новые методы молекулярной генетики, которые выявляют маркеры, успешно дифференцирующие близкие формы, и, кроме того, позволяют оценить генетическое родство таксонов на более совершенном уровне и получать информацию об их филогенезе и разнообразии. Использование комплексного подхода — молекулярно-генетического анализа в сочетании с методами кариосистематики, биохимической генетики и сравнительной морфологии - является приоритетным направлением в исследовании биоразнообразия, которое вносит существенный вклад в изучение эволюционных процессов и механизмов видообразования в природе.
Исследование различных механизмов видообразования принято проводить на целых группах близкородственных видов. Суслики голарктического рода Spermophilus Cuvier, 1825 служат удобной экспериментальной моделью для изучения комплекса систематических, эволюционных и генетических вопросов. Они отличаются высокой численностью, быстрой сменой поколений, достаточно хорошей морфологической изученностью. Для них характерны слабые морфологические различия близких видов и широкая изменчивость генетических признаков. Хромосомный полиморфизм, способность к гибридизации и
6
существование гибридных зон у некоторых видов сусликов обеспечивают устойчивый интерес к этой группе наземных беличьих.
Палеарктические суслики рода Spermophihis распространены на огромных пространствах Евразии, смена ландшафтных и климатических условий на территории которой способствуют созданию уникальных ситуаций для внутривидовой генетической изменчивости этих грызунов. Изучение меж- и внутривидовой изменчивости сусликов с различной структурой их ареалов позволяет проследить процесс генетической дифференциации таксонов разного уровня на всех последовательных этапах видообразования. Уже первые кариологические (Воронцов, Ляпунова, 1969; 1970; Lyapunova and Vorontsov, 1970) и аллозимные (Nadler et al., 1977; 1982) работы, проведенные в 60-80 гг. прошлого века, решили некоторые спорные вопросы таксономии сусликов Палеарктики и показали, что классификация рода Spermophihis соответствует узкой трактовке объема вида. Однако, ряд вопросов, связанных с проблемами систематики (установление таксономического ранга некоторых внутривидовых форм, с недостаточно четкой морфологической дифференциацией) (Орлов и др., 1978, Korablev, 1994) и филогении данной группы, сохраняются до сих пор. Их решению препятствует слабая изученность генетических аспектов разнообразия сусликов на молекулярном уровне. Использование комплексного подхода (цитогенетические и молекулярные методы) в исследовании генетического разнообразия рода Spermophihis позволит расширить представления о степени дифференциации близких форм неясного таксономического ранга, уточнить филогенетические связи таксонов более высокого уровня и тем самым помочь в решении спорных вопросов систематики.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить особенности генетического разнообразия и филогенетические взаимоотношения палеарктических сусликов рода Spermophihis и уточнить таксономический статус некоторых внутривидовых форм двух подродов (Cite/his и Colobolis) на основании данных цитогенетического и молекулярного исследований. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
7
1. Изучить распределение цитогенетических признаков (гетерохроматина и ядрышковых организаторов) в кариотипах сусликов двух подродов {Citellus и Colobolis).
2. Изучить генетическое разнообразие сусликов с помощью молекулярных RAPD-PCR маркеров.
3. Выяснить характер изменчивости цитогенетических и молекулярных характеристик сусликов рода Spermophilus на разных таксономических уровнях.
4. Реконструировать фено- и филогенетические связи между географическими популяциями, видами и подродами сусликов по данным RAPD-PCR.
5. Использовать полученные цитогенетические и молекулярные характеристики для решения спорных вопросов систематики сусликов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Подтверждена обоснованность выделения в составе рода Spermophilus подродов Citellus и Colobotis.
2. Уровень генетической дифференциации видов в подродах Citellus и Colobotis одинаково высок.
3. Подтверждена видовая самостоятельность Spermophilus suslicus (Giildenstaedt, 1770) и S. odessanus Nordmann, 1842 (=meridiooccidenta1is Migulin, 1927), рассматривавшихся до этого в качестве одного вида или подвидов. Подтверждена видовая самостоятельность S. erythrogenys Brandt, 1841, S. brevicauda Brandt, 1843 {=intermedius Brandt, 1844) и S. pallidicauda Satunin, 1903, рассматривавшихся до этого в качестве подвидов.
4. Установлена гибридизация между бледнохвостым S. pallidicauda и алашанским S. alaschanicus сусликами в двух популяциях Монголии.
Научная новизна. Впервые выполнено сравнительное исследование разных хромосомных форм сусликов двух подродов {Citellus и Colobotis) со спорным таксономическим статусом комплексом цитогенетических и молекулярных методов. Исследование различных кариоморф двух видов сусликов (крапчатого S. suslicus и краснощекого S. erythrogenys) показало, что отличия между ними достигают уровня "хороших" видов рода Spermophilus.
8
Критический анализ дифференцированных форм на хромосомном и молекулярном уровнях выявил целесообразность повышения их таксономического статуса до уровня самостоятельных видов: Spermophilus suslicus (Guldenstaedt, 1770) и S. odessanus Nordmann, 1842 (=mendiooccidentalis Migulin, 1927), S. erythrogenys Brandt, 1841, S. brevicauda Brandt, 1843 (=intermedius Brandt, 1844) и S. pallidicauda Satunin, 1903.
Впервые проведен сравнительный анализ генетического полиморфизма наземных беличьих методом RAPD-PCR позволил выяснить особенности генетического разнообразия, реконструировать филогенетические связи и уточнить систематические положение исследуемых форм рода Spermophilus. Показано, что подроды, виды и географические популяции сусликов рода Spermophilus генетически высоко дискретны.
Теоретическая и практическая значимость. Работа представляет исследование генетических и эволюционных аспектов изменчивости сусликов рода Spermophilus. Уточнение систематического положения ряда форм сусликов Палеарктики является вкладом в разработку систематики и филогении группы. Выявленные молекулярные и цитогенетические маркеры могут быть использованы для более широкого изучения популяций с целью дискриминации морфологически близких форм, обнаружения генетических гибридов, внешне неотличимых от родственных видов и поиска свидетельств межвидовой гибридизации. В связи с тем, что суслики являются основными компонентами степных (аридных) биогеоценозов, переносчиками ряда инфекционных заболеваний человека и животных, вредителями сельского хозяйства, установление их таксономического статуса также важно для решения практических задач эпидемиологии и паразитологии. Результаты изучения генетического разнообразия могут служить основой для разработки природоохранных мероприятий и стратегии сохранения редких видов сусликов.