КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
Количественный анализ осуществляют непосредственно на хроматограмме (на слое сорбента или на бумаге) или анализируемое вещество (пятно) вымывают из слоя сорбента (с бумажной полоски) после вырезания зоны, и полученный раствор анализируют каким-либо методом.
Непосредственно на хроматограммах количественный анализ можно осуществлять по размеру пятна (полуколичественное определение), спектрофотометрическим методом по спектрам поглощения (фотоденсиметрия) и по спектрам отражения, а также флуориметрическим, рентгенофлуорисцентным и радиометрическим методами. Определение компонентов после смывания можно выполнить, например, спектрофотометрическим, флуориметрическим, атомно-абсорбционным методами. Предел обнаружения дается в виде количества, приходящегося на 1 г сорбента, но лучше всего в виде концентрации в анализируемой пробе. Относительные стандартные отклонения при использовании спектрофотометрических методов анализа не превышают 1%.
В настоящее время плоскостная хроматография , главным образом ТСХ, интенсивно развивается. Представляется важным развитие радиальной тонкослойной хроматографии: растворитель с регулируемой скоростью подается в центр пластины, заставляя зоны перемещаться от центра к периферии. Оказалось, что существенно ускоряется процесс разделения (1 – 4 мин) сложной смеси и для этого достаточно иметь пластины со слоем сорбента длиной 20 – 25 мм. За счет создания принудительного движения подвижной фазы с регулируемой скоростью уменьшения размера чачтиц и насыщения пространства над пластиной парами растворителя удалосб существенно ускорить процесс и повысить четкость разделения.
2.2. ИК и УФ спекторофотометрия
УФ – спектрофотометрические измерения проводят обычно в растворах. В качестве растворителя используется дистиллированная вода, кислоты, щелочи, спирты (метанол, этанол), некоторые другие органические растворители. Растворитель не должен поглощать в той области спектар, что и анализируемое вещество. Характер спектра (структура и положение полос поглощения) может изменяться в различных растворителях, а также при изменениях рН среды.
Метод УФ – спектрофотометрии включен в ГФ IХ, ГФ Х, а также в последние издания фармакопей почти всех стран для определения подлинности, чистоты и количественного определения лекарственных препаратов.
Изучение спектров поглощения химических веществ с разной структурой позволило установить, что основными факторами, обуславливающими поглощение света, являются наличие так называемых хромофоров, т. е. ненасыщенность (двойные и тройные связи), наличие карбонильной, карбоксильной, амидной, азо-, нитрозо-, нитро- и других функциональных групп. Каждая функциональная группа характеризуется поглощением в определенной области спектра. Однако имеется ряд факторов (присутствие нескольких хромофорных групп, влияние растворителя и др.), приводящих к смещению полос поглощения в сторону больших длин волн (батохромное смещение) или в сторону коротких длин волн (гипсохромное смещение). Кроме смещения может наблюдаться эффект увеличения (гиперхромный) или уменьшения (гипохромный) интенсивности поглощения.
В связи с этим для идентификации вещества по его УФ –спектру применяют обычно метод сравнения со спектром известного вещества, полученным в тех же условиях. Характеристикой спектра поглощения вещества является поглощение максимумов (минимумов) поглощения, а также интенсивность поглощения, что характеризуется величиной оптической плотности или удельного показателя поглощения.
Иногда для идентификации фармакопейных препаратов вместо абсолютных величин поглощения проводится отношение абсорбции при различных длинах волн. Инфракрасные (колебательные) спектры используются фармакопеями многих стран для идентификации лекарственных препаратов. ИК спектры большинства органических соединений в отличии от УФ спектров характеризуются наличием числа пиков поглощения.
Метод ИК –спектроскопии дает возможность получить наиболее полную информацию о строении и составе анализируемого вещества, позволяющую идентифицировать очень близкие по структуре соединения. В ГФ Х метод инфракрасной спектроскопии принят для идентификации лекарственных веществ с полифункциональными группами путем сравнения со спектрами стандартных образцов, снятыми в одиночных условиях.
Люминесценция – это свечение атомов, молекул, ионов и других более сложных комплексов, возникающее в результате электронного перехода в этих частицах при их возвращении из возбужденного состояния в нормальное. Отсюда следует, что для возбуждения люминесценции необходимо проводить энергию извне, поскольку она теряется при излучении. Наиболее часто в аналитической практике используют фотолюминесценцию и хемилюминесценцию.
Люминесцентный анализ характеризуется высокой чувствительностью, это обусловлено тем, что люминесцентный метод относится к силовым, в котором выходной сигнал увеличивается с увеличением интенсивности источника излучения. Для большинства определяемых этим методом соединений пределы обнаружения не превышают 10-3 мкг/мл.
В идеальных условиях (высокие значения квантовых выходов люминесценции, молярных коэффициентов поглощения, отсутствие поправки на контрольный опыт и др.), даже применяя в качестве источника возбуждения лампы, удается достичь пределов обнаружения на уровне пикограммов в миллилитре. В модельных экспериментах с родамином 6 ис, сорбированном на отдельных частицах кремнезема диаметром 10 мкг, при использовании флуоресцентного микроскопа с лазером в качестве источника возбуждения удалось определить ≈ 8000 молекул красителя (≈ 6 * 10-18 г), сорбированных на индивидуальной частице. Высокая чувствительность определения, в ряде случаев большой диапазон определяемых содержаний – иногда до 4 порядков величин концентраций – при той же воспроизводимости результатов анализа, как и в молекулярной абсорбционной спектроскопии и предопределили развитие люминесцентного метода анализа.
Практическое применение
В неорганическом люминесцентном анализе наиболее распространены методы с использованием органических реагентов. Здесь есть свои особенности. Основная из них – более резко выраженная зависимость спектрально-люминесцентных свойств комплекса металла от природы и взаимного расположения электронных уровней лиганда и иона металла – комплексообразователя.
Наиболее распространенными люминесцентными реагентами являются 8-оксихинолин и его производные, оксиазо- и оксиазометиновые соединения, полиоксифлавоны, родаминтовые красители.
8-оксихинолин является неспецефическим реагентом, образующим флуорисцирующие хелаты более чем с 25 элементами, в том числе с Li, Ca, Mg, Ba, Al. Определению обычно предшествует экстракция, с помощью которой достигается требуемая селективность, поскольку спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции 8-оксихинолинатов практически не отличаются.
Другими большими группами флуоресцентных реагентов являются оксиазо- и оксиазолитивные соединеня (основания Шиффа). Исходные соединения этих классов – соответственно 2,2-диоксиазобензол и салицилиден-2-аминофенол. Их многочисленные производные широко применяют для определения Al, Ga, Mg и других элементов, образующие неокрашенные комплексы.
Полиоксифлавоны являются производными 2-фенил-1,4-бензопирозона. Они часто встречаются в природе в составе растительных компонентов. К соединениям этой группы относятся флавонол, 3-оксифлавон, морин, квертецин. Их применяют для определения Zn, Th, Al в сильнокислых растворах и Ве в щелочах.
Высокочувствительными и селективными флуориметрическими реагентами являются родаминовые красители. Их использование в неорганическом анализе основано на большей растворимости в органической фазе (чаще всего это бензол) ионных асоциатов катионов красителей с крупными анионами (в состав которых входит определяемый компонент) по сравнению с растворимостью простых солей реагента. Родаминовые красители применяют для определения Au, Ga, Hg, B и других элементов после переведения их в галогенидные ацидокомплексы.
Люминесцентное определение органических соединений основано главным образом на: а) прямых методах анализа по флуорисценции, с использованием различий в условиях возбуждения излучения и излучения определяемого соединения и сопутствующих компонентов; б) эффекте Шпольского; в) измерении фосфоресценции при комнатной температуре.
Эффект Шпольского – возникновение квазилинейчатых (комплексов) спектров люминесценции и поглощения сплощных органических молекул в специально подобранных растворителях, размеры молекул которых примерно совпадают с размерами молекул люминофора (чаще всего это Н-парафины) при низких температурах (жидкий азот или жидкий гелий). В таких условиях исследуемые молекулы изолированы друг от друга и местно закреплены в растворителе. Вследствие этого их электронно-колебательные спектры испускания и поглощения состоят не из широких полос, а из серии узких спектральных линий, напоминающих атомные спектры (из называют квазилинейчатыми спектрами) и обладают ярко выраженной индивидуальностью. Такие спектры наиболее характерны для полициклических ароматических углеводородов.
Методы анализа, основанные на эффекте Шпольского, позволяют определять одновременно несколько индивидуальных соединений (главным образом полициклических ароматических углеводородов) в их смеси с абсолютным пределом обнаружения до 10-11 г.