Найденные в процессе нашего поиска белки выполняют самые разные функции в клетке:
1) Ревертазы:
POL2(mouse), LIN1(human).
2) ДНКтопоизомеразы:
TOP1(crigr, human, mouse).
3) Хеликазы:
XPB(human, mouse).
4) Ферменты:
GL6S(caphi, human), NOX1(human), PPOL(bovin, crigr, human, mouse, rat), XRN2(human, mouse).
5) Белки сплайсинга:
CB80(human), PR16(human).
6) Факторы транскрипции:
CBF(human), E2F6(human), HES2(mouse), SOX8(human, mouse), SOX9(human, pig), SX10(human, mouse, rat), SX15(human, mouse).
7) Факторы трансляции:
IF2B(human, mouse, rabit), IF3A( human, mouse).
8) Белки хроматина:
СBX1(human), CND2(human).
9) Киназа:
NIPK(human, mouse, rat).
10) Протеинкиназы:
CRK7(human), PR4B(human, mouse), STK3(human).
11) ДНК-полимеразы:
DPD3(mouse).
12) РНК-полимеразы:
RPC4(human, mouse).
13) Факторы роста:
HGFL(human).
14) Белки теплового шока:
HS7C(crigr).
15) Рецепторы(в том числе, ядерные рецепторы):
IP3R(bovin, human, mouse, rat), PPAR(canfa, cavpo, human, mouse, rat), PPAT(bovin, crigr, human, macmu, mouse, pig, rabit, rat), RXRA(human, mouse, rat), RXRB( human, mouse, rat), RXRG(human, mouse), SRPR(human).
16) белки, имеющие отношение к апоптозу:
APL3(human), NIPK(human, mouse, rat), REQU(human, mouse), SON(human, mouse).
Среди этих белков есть те, о которых точно известно, что они являются мишенями каспаз: TOP1, PPOL, THYA, IF2B, CB80 , причём то, что последние два белка являются субстратами каспаз было предсказано в нашей лаборатории на основании описанного алгоритма и затем подтверждено экспериментально. Это свидетельствует о том, что алгоритм поиска не лишён разумности. Остальные белки, найденные в настоящей работе, должны быть дополнительно проанализированы.
С нашей точки зрения наибольший интерес представляют белки, являющиеся ядерными рецепторами (Peroxisome proliferator activated receptor alpha(PPAR), Peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAT), Retinoic acid receptor RXR-alpha (RXRA), Retinoic acid receptor RXR-beta (RXRB)). Во-первых, они играют важную роль в передаче сигналов к ядру (поэтому мы можем предположить, что после расщепления таких белков каспазами, клетка нормально функционировать уже не сможет). Во-вторых, мотив “каспазный сайт внутри двучастичного NLS “ консервативен у этих рецепторов, т.е. он есть у соответствующего белка человека, быка, мыши, свиньи, кролика, крысы и т.д. Поэтому, вероятность, что этот мотив имеет функциональное значение, выше, чем у других найденных нами белков.
2. По патерну 2 (см. Материалы и методы) было найдено 145 белков, но только 43 из них оказались новыми по сравнению с поиском по патерну 1.
Наибольший экспериментальный интерес для нас представляют те белки, в которых в большей степени консервативен мотив «каспазный сайт внутри двучастичного NLS». Это 6 белков: Beta-arrestin 1(ARR1, human, rabbit, rat), Beta-arrestin 2(ARR2, bovin, human, mouse, rat), DNA ligase 1 (DNL1, human, mouse, rat), Transcription factor 4 (ITF2, human, dog, mouse, rat), Probable U3 small nucleolar RNA-associated protein 11(UT11, human, mouse, rat), Cytochrome P450 4B1 (CP4B, human, mouse, rabbit, rat).
Показано, что из них ядерными являются DNL1, UT11 и ITF2; расщепление каспазой внутри NLS должно приводить к изменению внутриклеточной локализации этих белков.
Относительно ARR1 и ARR2 известно, что, хотя оба являются в основном цитоплазматическими, они бывают в ядре, и за ядерную локализацию отвечает
N-концевой домен (аминокислоты 1-185) – тот самый, в котором находиться интересующий нас мотив (аминокислоты 24-53). Про Beta-arrestin 2(ARR2) есть данные, что он шатлирует между цитоплазмой и ядром; если при апоптозе действительно отщепляется его N-концевой пептид, содержащий часть NLS, то шатлирование станет невозможным.
Шестой белок, CP4B, ядерным не является – он заякорен в эндоплазматическом ретикулуме, поэтому мы его из списков белков-кандидатов исключаем.
3. В поисках по патерну 3 и 4 (см. Материалы и методы) мы искали белки, у которых сайт расщепления каспазой находится не внутри двучастичного NLS, а справа или слева от него. При расщеплении каспазой таких белков двучастичный NLS остался бы целым, и один из фрагментов белка своей ядерной локализации бы не потерял. Вопрос в том, с функциональной частью белка останется NLS или наоборот, функциональный фрагмент белка NLS потеряет. На наш взгляд разумнее исследовать белки, у которых при расщеплении NLS оставался бы с меньшей половинкой, таким образом, большая часть белка теряла бы свою ядерную локализацию. По такому принципу мы отобрали белки, наиболее интересные для экспериментальной проверки: DNA polymerase alpha catalytic subunit (DPOA), Inhibitor of nuclear factor Kappa B kinase beta subunit (IKKB), Ras GTPase-activating protein 1 (RSG1), c-GMT-specific 3’, 5’-cyclic phosphodiesterase alpha’-subunit(CN5A), Dual-specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinase 1A (DYRA), Tropomyosin 1 alpha chain (TPM1).
Выводы
Следующую группу белков можно считать перспективными кандидатами для дальнейшего анализа, в том числе для экспериментальной проверки расщепления этих белков по найденным в настоящей работе сайтам в процессе апоптоза: PPAR, PPAT, RXRA, RXRB, ARR1, ARR2, DNL1, ITF2, UT11, DPOA, IKKB, RSG1, CN5A, DYRA, TPM1.
План дальнейшей работы
1) Экспериментальная проверка наиболее интересных белков.
Список литературы
1. Green, D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin. (2000). Cell, 102: 1-4.
2. Blajersky A.L., Kaufmann S.H. Methods for detecting proteolysis during apoptosis in intact cells.
3. Görlich D., Mattaj W. Nucleocytoplasmic transport. (1996). Science, 271: 1513- 1518.
4. Dingwall C., Laskey R.A. Nuclear targering sequences – a concensus? (1991). Trends Biochem. 16: 478-481.
5. Wang P., Wu Y., Ge X., Ma L., Pei G. Subcellular localization of beta-arrestin is determine their intact N domain and the nuclear export signal at C terminus.(2003).
J BiolChem.