Условия хранения. Замораживают при температуре ниже минус 40 град. C.
Условия транспортирования. В замороженном виде в сосуде Дьюара или термоконтейнере с сухим льдом.
Мазки-отпечатки, полученные со слизистой оболочки верхних дыхательных путей (лучше) и внутренних органов, готовят на чистых обезжиренных эфиром предметных стеклах, к которым прижимают слизистые или свежие срезы органов. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в течение 20 мин. в охлажденном до от 2 град. C до 8 град. C химически чистом ацетоне. Помещают в штативы для предметных стекол (на ребро). Делают пометку, что мазки фиксированы.
Условия хранения. При температуре от 2 град. C до 8 град. C в течение недели, при температуре минус 20 град. C - до 6 месяцев.
Условия транспортирования. При температуре от 2 С до 8 С. Температура ниже минус 40 град. C обеспечивается в сосуде Дьюара, наполненном жидким азотом (-196 град. C) или в термоконтейнере с сухим льдом (-70 град. C).
Термоконтейнер и сосуд Дьюара обертывают бумагой (обшивают материалом), ошнуровывают, опечатывают и транспортируют в лабораторию с нарочным. К доставляемому материалу прилагают сопроводительное письмо, акт упаковки. На термоконтейнере и сосуде Дьюара должен быть особый знак (ярлык с отметкой) "Опасно! Не открывать во время перевозки".
Если предполагается хранение и транспортировка материала в сосуде Дьюара или в термоконтейнере с сухим льдом, для забора материала используют герметичные пластиковые контейнеры, устойчивые к низким температурам, или криопробирки. Сосуды Дьюара и контейнеры с сухим льдом запрещается закрывать герметически, чтобы не препятствовать выходу испаряющегося понемногу азота и углекислоты.
Перед выездом в полевые условия сосуды Дьюара должны быть проверены в лаборатории на соответствие паспортным данным и пригодность для эксплуатации и перевозки. При заправке, погрузке, выгрузке и переноске сосудов Дьюара необходимо иметь обычную спецодежду, обувь и брезентовые рукавицы, чтобы в случае разлива или разбрызгивания азота исключить возможность попадания его на открытые части тела. При транспортировке сосуды Дьюара должны быть тщательно закреплены, чтобы исключить опрокидывание, разбрызгивание или разлив азота.
Допускается только однократное замораживание и оттаивание любого материала.
Вирус резко снижает титры при даже однократном замораживании-оттаивании, поэтому число замораживаний-оттаиваний при взятии проб и их перевозке необходимо свести к минимуму, а по возможности - исключить.
6. Методы лабораторных исследований
Лабораторные исследования проводят в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03, регламентирующими работу с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности).
Метод флуоресцирующих антител (МФА)
Для МФА используют фиксированные мазки-отпечатки органов животных и слизистых оболочек. Реакцию проводят в соответствии с инструкцией к диагностическому препарату "Флуоресцирующие иммуноглобулины для ранней дифференциальной диагностики гриппа A (H5)", выпускаемого в ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов" НИИ гриппа РАМН.
В каждом мазке просматривают не менее 20-25 полей зрения.
Оценку степени яркости свечения вирусных антигенов, окрашенных люминесцирующими иммуноглобулинами, проводят по общепринятой шкале:
++++ (4+) - яркая флуоресценция внутри клеток тканей;
+++ (3+) - умеренная флуоресценция внутри клеток тканей;
++ и + (2+ и 1+) - слабая флуоресценция внутри (или вне) клеток тканей.
Положительным результатом иммунофлуоресцентного исследования является обнаружение в препарате не менее 5-8 клеток ткани органа, имеющих характерные включения со специфической флуоресценцией на три и четыре плюса.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Молекулярно-генетические исследования проводят в соответствии с действующими нормативными документами: Методические указания "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности" МУ 1.3.1794-03; Временные методические рекомендации "Лабораторная диагностика "атипичной пневмонии" (SARS) методом ПЦР", утв. Минздравом России 03.05.2003 г. Инструкция по применению тест-системы для выявления РНК вируса гриппа A и идентификации субтипов H5 и H7 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
Тест-система позволяет выявлять РНК вируса гриппа A и идентифицировать субтипы H5 и H7 в материале от павших и больных животных. Материалом для исследования являются: фекалии, мазки из клоаки, трахеальные смывы, внутренние органы (фрагменты трахеи и легких, селезенка, мозг). Тест-система включает 4 комплекта реагентов: для выделения РНК, для получения кДНК на матрице РНК, для амплификации участков кДНК (проведения ПЦР), для электрофоретического анализа амплифицированной кДНК и содержит контрольные образцы.
Выявление на электрофореграмме специфичного фрагмента кДНК размером 365 п.н. свидетельствует о наличии в пробе РНК вируса гриппа A. При идентификации субтипа H5 вируса гриппа A выявляется специфичный фрагмент размером 235 п.н, а субтипа H7 - 360 п.н.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Для исследования используют индивидуальные сыворотки крови птиц без признаков гемолиза и бактериальной контаминации объемом 0,3 - 0,5 мл. Постановку реакции осуществляют согласно временному наставлению по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц (ВГП) иммуноферментным анализом.
Учет результатов проводят на спектрофотометре при длине волны 405-410 нм.
Все этапы инкубации проводят в течение 30 мин. при температуре 20-30 град. C.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Выявление специфических антител к вирусу гриппа птиц в сыворотках крови птиц осуществляют в соответствии с наставлением по применению "Набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)" микрометодом.
Учет реакции проводят визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде "пуговки"). Титром антител в сыворотке считают наибольшее ее разведение, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов антигеном вируса гриппа.
Выявленные в ходе лабораторного исследования положительные пробы отправляют для выделения вируса и его идентификации в специализированные учреждения.
7. Обеспечение требований биологической безопасности
при проведении эпизоотологического мониторинга
за гриппом птиц в природных условиях
7.1. Обеспечение биологической безопасности работ при проведении эпизоотологического мониторинга в потенциальных природных очагах гриппа птиц
1. В проведении обследования участвуют сотрудники противочумных учреждений, учреждений Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации, других медико-биологических организаций имеющие допуск к работе с ПБА I-II групп патогенности. Вспомогательный персонал (водители, стрелки и т.п.) допускается к работе после проведения инструктажа.
2. Весь состав отряда или экспедиции должен быть ознакомлен с требованиями биологической безопасности при работе с возбудителями природно-очаговых инфекций, циркулирующих на данной территории. Ответственным за соблюдение этих требований при проведении отлова диких животных и сбора полевого материала является руководитель (начальник) эпидемиологического отряда (экспедиции).
3. Любой материал считается потенциально опасным в отношении возможного содержания возбудителей природно-очаговых болезней, свойственных той ландшафтной зоне, в пределах которой он собран.
4. Рекогносцировочное обследование местности, установку орудий лова осуществляют в рабочей одежде (комбинезон или противоэнцефалитный костюм, сапоги).
5. Проверку выставленных орудий лова и сбор полевого материала проводят в рабочей одежде, дополненной фартуками и нарукавниками из водонепроницаемой ткани (пленки), резиновыми перчатками (2 пары). По окончании работ фартуки, нарукавники и перчатки дезинфицируют.
6. Для защиты органов дыхания используют одноразовые ватно-марлевые повязки или противопылевые респираторы. Предпочтение отдается респираторам класса не ниже FFP2.
7. Защиту органов зрения осуществляют плотно прилегающими очками.
8. Дезинфекцию орудий лова и других инструментов проводят ежеднзвно по окончании работы путем прогревания на солнце (в летнее время), кипячения, обработки дезинфицирующими растворами с последующим проветриванием, ящики и отсадники дезинфицируют.
9. Разбор полевого материала, вскрытие животных проводят в противочумном костюме I типа. Защита органов дыхания аналогична п. 6 настоящего раздела. Особенности забора материала и подготовки проб для транспортировки в лабораторию изложены в разделе 5.4. "Сбор полевого материала для лабораторного исследования".
10. По окончании работ, приведенных в п. 9, инструменты и защитную одежду дезинфицируют (см. приложение 4). Использованные наконечники, пипетки обеззараживают погружением в 6%-ый раствор перекиси водорода на 60 мин. Дозаторы обеззараживают двукратным протиранием с интервалом 15 мин. 6%-ым раствором перекиси водорода (экспозиция 120 мин).