4.4. Правила сбора, хранения и транспортировки материала для лабораторного исследования
Все работы по сбору, хранению и транспортировке полевого материала, подозрительного на содержание вируса гриппа птиц типа А (субтипы Н5 и Н7), проводят в соответствии с действующими СП 1.2.036—95 и МУ 3.1.1027—01. Работу по сбору полевого материала проводят в сезонной защитной одежде, дополненной респиратором, защитными очками и резиновыми перчатками (Приложение 6 СП 1.3. 1285—03).
Для лабораторного исследования из природных биотопов берут:
- птиц, птенцов;
- яйца птиц;
- фекалии птиц и (или) мазок из клоаки и трахеи;
- мелких млекопитающих околоводных биотопов;
- воду и ил в местах гнездований.
Добытых птенцов, мелких птиц и млекопитающих (живых и агонирующих особей предварительно умерщвляют с помощью корнцанга) помещают в мешочки из плотной белой ткани (каждого животного в отдельный мешочек), края мешочков два раза подворачивают и туго завязывают. Используют мешочки рубцом наружу. Их снабжают этикетками с указанием даты, точного адреса, стации, вида животного, фамилии сборщика. Для транспортировки тканевые мешочки с тушками животных помещают в клеенчатый мешок.
У крупных птиц берут мазок из клоаки и отсекают голову с участком шеи. Голову помещают в отдельный клеенчатый мешок, который снабжают этикеткой.
Условия хранения. При температуре от 2 0С до 8 0С — в течение суток, при необходимости длительного хранения животных вскрывают, органы и ткани замораживают при температуре ниже минус 40 0С.
Условия транспортирования. Тушки животных и головы — в течение суток при температуре от 2 0С до 8 0С. Органы — в замороженном виде в сосуде Дьюара или термоконтейнере с сухим льдом.
Мазки из клоаки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. После забора материала тампон (рабочую часть зонда) помещают в стерильную одноразовую микропробирку с 500 мкл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида или фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают и ставят в штатив, который затем помещают в термоконтейнер с охлаждающими элементами.
Условия хранения. При температуре от 2 0С до 8 0С — в течение 3 суток. При необходимости длительного хранения замораживают материал при температуре ниже минус 40 0С.
Условия транспортирования. При температуре от 2 0С до 8 0С — в течение 3 суток. В замороженном виде – в сосуде Дьюара или термоконтейнере с сухим льдом.
Если птицу необходимо оставить живой (представители редких видов), у нее после отлова берут мазки из клоаки.
Яйца птиц забирают из гнезда (не более 50% кладки), маркируют и помещают в пластиковые емкости с углублениями для яиц, перекладывая ватой. Емкости помещают в металлический контейнер и доставляют в лабораторию.
Условия хранения. В течение 3 суток хранят при температуре от 2 0С до 8 0С. При необходимости длительного хранения содержимое яиц переносят в стерильные пластиковые флаконы с завинчивающимися крышками и замораживают при температуре ниже минус 40 0С.
Условия транспортирования. В течение нескольких часов после сбора – при температуре окружающей среды. В течение 3 суток при температуре от 2 0С до 8 0С. Содержимое яиц — в замороженном виде при температуре ниже минус 40 0С в термоконтейнере с сухим льдом.
Фекалии птиц (4—5 г) собирают одноразовыми лопатками (шпателями) в стерильные пластиковые контейнеры (пластиковые флаконы с завинчивающимися крышками).
Условия хранения. При температуре от 2 0С до 8 0С — в течение 3 суток, при температуре минус 40 0С – 30 дней.
Условия транспортирования. При температуре от 2 0С до 8 0С — в течение 3 суток. Замороженный материал — в термоконтейнере с охлаждающими элементами при температуре минус 70 0С.
Воду и ил собирают в местах гнездовий в прибрежной зоне. Ил (5—10 г) собирают черпаками и переносят в стерильные пластиковые флаконы с завинчивающимися крышками. Воду в объеме 1,0 л собирают в стерильные пластмассовые бутылки с завинчивающимися крышками. Контейнеры и бутылки маркируют и помещают в металлический контейнер с поглощающим материалом, количество которого должно быть достаточным для адсорбции содержимого в случае нарушения целостности транспортной тары.
Условия хранения. При температуре от 2 0 до 8 0С.
Условия транспортирования. При температуре от 2 0С до 8 0 .
При заборе проб органов используют стерильный хирургический инструмент (ножницы, скальпели, пинцеты) и стерильную посуду.
Внутренние органы (фрагменты трахеи, легких, селезенки, мозга, синусы, воздухоносные мешки, кишечник) от забитой или павшей птицы, птенцов, а также мелких млекопитающих получают при вскрытии животных. Перед вскрытием тушку погружают в дезинфицирующий раствор (5 % хлорамин Б) на 20—30 сек. При взятии проб органов животных место будущего разреза обрабатывают 5 %—ным раствором йода или 70 %—ным раствором этилового спирта и стерильными инструментами разрезают кожу, мышцы брюшной стенки или кости черепа. Разрез стенки брюшной полости делают «фартуком», доводя боковые линии разреза по ребрам выше уровня сердца, и откидывают образовавшийся лоскут, чтобы обнажить внутренние органы. Перед взятием головного мозга срезают всю затылочную часть черепа. С помощью второго набора инструментов отсекают кусочки внутренних органов размером от небольшой горошины до лесного ореха, над пламенем горелки укладывают пробы в стерильные одноразовые пластиковые пробирки или контейнеры, герметично закрывают.
Условия хранения. Замораживают при температуре ниже минус 40 0С.
Условия транспортирования. В замороженном виде — в сосуде Дьюара или термоконтейнере с сухим льдом.
Мазки-отпечатки, полученные со слизистой оболочки верхних дыхательных путей (лучше) и внутренних органов, готовят на чистых обезжиренных эфиром предметных стеклах, к которым прижимают слизистые или свежие срезы органов. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в течение 20 мин в охлажденном от 2 0С до 8 0С химически чистом ацетоне. Помещают в штативы для предметных стекол (на ребро). Делают пометку, что мазки фиксированы.
Условия хранения. При температуре от 2 0С до 8 0С — в течение недели, при температуре минус 20 0С – до 6 месяцев.
Условия транспортирования. При температуре от 2 0С до 8 0С.
Температура ниже минус 40 0С обеспечивается в сосуде Дьюара, наполненном жидким азотом (минус 196 0С) или в термоконтейнере с сухим льдом (минус 70 0С).
Транспортировку образцов осуществляют в соответствие с СП 1.2.036—95. Термоконтейнер и сосуд Дьюара обертывают бумагой (обшивают материалом), ошнуровывают, опечатывают и транспортируют в лабораторию с нарочным. К доставляемому материалу прилагают сопроводительное письмо, акт упаковки. На термоконтейнере и сосуде Дьюара должен быть особый знак (ярлык с отметкой) «Опасно! Не открывать во время перевозки». Если предполагается хранение и транспортировка материала в сосуде Дьюара или в термоконтейнере с сухим льдом, для забора материала используют герметичные пластиковые контейнеры, устойчивые к низким температурам, или криопробирки. Сосуды Дьюара и контейнеры с сухим льдом запрещается закрывать герметически, чтобы не препятствовать выходу медленно испаряющихся азота или углекислоты.
Перед выездом в полевые условия сосуды Дьюара должны быть проверены в лаборатории на соответствие паспортным данным и пригодность для эксплуатации и перевозки. При заправке, погрузке, выгрузке и переноске сосудов Дьюара необходимо иметь обычную спецодежду, обувь и брезентовые рукавицы, чтобы в случае разлива или разбрызгивания азота исключить возможность попадания его на открытые части тела. При транспортировке сосуды Дьюара должны быть тщательно закреплены, чтобы исключить опрокидывание, разбрызгивание или разлив азота.
Допускается только однократное замораживание и оттаивание любого материала.
5. Методы лабораторных исследований
Лабораторные исследования проводят в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285—03, регламентирующими работу с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности), МУК 4.2.2136-06 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА).
Метод флуоресцирующих антител (МФА)
Для МФА используют фиксированные мазки-отпечатки органов животных и слизистых оболочек. Реакцию проводят в соответствии с инструкцией к диагностическому препарату «Флуоресцирующие иммуноглобулины для ранней дифференциальной диагностики гриппа А (Н5)», выпускаемого в ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург).
В каждом мазке просматривают не менее 20—25 полей зрения.
Оценку степени яркости свечения вирусных антигенов, окрашенных люминесцирующими иммуноглобулинами, проводят по общепринятой шкале:
++++ (4+) – яркая флуоресценция внутри клеток тканей;
+++ (3+) — умеренная флуоресценция внутри клеток тканей;
++ и + (2+ и 1+) – слабая флуоресценция внутри (или вне) клеток тканей.
Положительным результатом иммунофлуоресцентного исследования является обнаружение в препарате не менее 5—8 клеток ткани органа, имеющих характерные включения со специфической флуоресценцией на три и четыре плюса.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Молекулярно-генетические исследования проводят в соответствии с действующими нормативными документами: МУ 1.3.1794 – 03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности»; а также в соответствии с Рекомендациями ВОЗ по обнаружению вируса гриппа птиц субтипа H5N1 в образцах от людей с подозрением на заболевание (ВОЗ, Женева, август 2007) и Инструкцией по применению тест-системы для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипов Н5 и Н7 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (например, наборы «АмплиСенс Influenza virus А H5N1-FL» или «ГРИПП», производство ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора).