9. Материалы для бактериологического и серологического
исследования, их сбор, транспортировка и хранение
95. Сбор голодных взрослых клещей и нимф (Ixodes) с растительности осуществляют на стандартный флаг по общепринятой методике. Их удобно сохранять и транспортировать, заворачивая в слегка увлажненный медицинский бинт, который затем помещают в полиэтиленовый мешочек. В таких бинтах клещи остаются живыми при 4-8ºC (т.е. в обычном холодильнике) до 2 и более месяцев.
96. Для транспортировки клещей на значительное расстояние используют сумки или контейнеры, содержащие хладагенты.
97. Для микробиологической диагностики ЛБ (получения изолятов) используют биопсийные материалы из кожных поражений, ликвор от больных с генерализованной нейроинфекцией, реже - кровь и синовиальную жидкость. У диких позвоночных-носителей для посева берут ткани из органов (кусочки ушной раковины, сердца, мочевого пузыря, почки, селезенки, печени, иногда - кровь, мочу). От клещей - обычно среднюю кишку.
98. Кровь и другие биологические жидкости содержат боррелий редко и лишь в виде единичных клеток; методы обогащения пока не разработаны. Поэтому для диагностики методами микроскопии и посева их обычно не используют.
99. Материалы для изоляции боррелий хранению и транспортировке не подлежат. Поэтому высевы возбудителя из любых источников следует проводить при наличии на месте условий, обеспечивающих стерильность работы, и среды для изоляции.
100. Кусочки тканей из биопсийных и секционных материалов для патогистологической диагностики следует фиксировать в 2-3 сменах 4% (по содержанию формальдегида) нейтрального формалина. Фиксация в последней смене (через 1-2 суток) может осуществляться неограниченно долго, и материал для микроскопического обнаружения возбудителя можно сохранять при комнатной температуре и транспортировать в формалине без ограничений. Длительная (свыше 2 недель) фиксация в нейтральном формалине обычно повышает качество препаратов, предназначенных для импрегнации серебром. Возможна также транспортировка и длительное хранение (до окраски) фиксированных на пламени мазков из средней кишки клещей.
101. Для серологического исследования используют сыворотку или плазму крови, реже - синовиальную жидкость или ликвор. Биологические жидкости, окрашенные в результате лизиса эритроцитов, помутневшие или содержащие взвеси, для исследования непригодны. Поэтому они должны быть тщательно очищены от примеси эритроцитов и других взвесей центрифугированием (500-1000 обор., 5-10 мин.).
102. Свободные от включений стерильные пробы запаивают в стерильные ампулы или помещают в герметичные стерильные флаконы с резиновыми пробками. В таком виде их можно хранить при 4°C (до года) и транспортировать.
103. Хранение в замороженном состоянии не рекомендуется, т.к. в результате неоднократного замораживания и оттаивания возможно снижение титров антител. Хорошему сохранению способствует добавление консерванта (1 капля 1% раствора азида натрия на 1 мл биологической жидкости), не влияющего на результаты серологической реакции.
104. Для массовых обследований населения пригодны пробы крови, взятые из пальца на фильтровальную бумагу. Для этого можно нарезать листы примерно 3x10 см. На каждом листке с помощью специального шаблона или циркуля с карандашным грифелем предварительно намечают по 2 окружности диаметром около 2 см на расстоянии 2-3 см друг от друга. Для разных партий фильтровальной бумаги заранее определяют диаметр окружности таким образом, чтобы на ограниченную ею площадь поместилось 0,1 см3 крови. Каплю крови из пальца помещают в центр окружности так, чтобы при расплывании по бумаге капля заняла все пространство в пределах окружности. На один листок берут не менее 2 капель на случай необходимости перестановки реакции. На листке простым мягким карандашом проставляют номер, соответствующий истории болезни или опросному листу пациента. Листки просушивают на воздухе в защищенном от пыли и солнечных лучей помещении, затем их помещают в полиэтиленовые пакеты (не более 10 в пакет), которые закрывают или запаивают. В таком виде при необходимости пробы могут храниться при 4-6°C не более 4-5 месяцев.
105. При транспортировке возможно кратковременное (не более недели) содержание проб при комнатной температуре. Для исследования такие пробы вырезают ножницами, измельчают и вымачивают в 0,95 мл физиологического раствора (примерно 8-10 часов) при температуре 4-6°C, затем промешивают пипетированием и отсасывают. Полученную жидкость в серологических реакциях используют как сыворотку, разведенную 1:20.
106. Все материалы, поступающие в лабораторию для микробиологического и серологического обследования, маркируют. В сопроводительных документах должна содержаться характеристика материала и сведения о его источнике, данные о времени и месте сбора образцов.
10. Методы лабораторной диагностики
105. Методы лабораторной диагностики клещевых боррелиозов можно условно подразделить на две группы:
1) Методы, направленные на прямую детекцию возбудителя, его антигенов или ДНК;
2) Методы, направленные на обнаружение антител к B.burgdorferi sensu lato.
106. Культуральный метод . Боррелии могут быть выделены in vitro методом культивирования в жидкой питательной среде BSK II (модифицированная среда Barbour-Stoenner-Kelly). В качестве клинического материала для посевов служат пораженные ткани (биоптаты кожи из краевой зоны кольцевидной МЭ, из доброкачественной лимфоцитомы кожи и хронического атрофического акродерматита) и биологические жидкости больного (кровь, спинномозговая и внутрисуставная жидкости).
107. Так как количество спирохет в тканях и жидкостях организма незначительно, то эффективность выделения боррелий варьирует в пределах 6–45%. В 5–10% случаев боррелии выделяют из цереброспинальной жидкости, из крови – менее 4%.
108. Эффективность высевов зависит от стадии заболевания. Культуральный метод, хотя и считается «золотым стандартом», но не имеет широкого применения в виду его длительности (от 3–4 до 10 недель), дороговизны и недостаточной эффективности.
109. Прямая микроскопия. При микроскопическом исследовании в качестве клинического материала используют кровь, спинномозговую и внутрисуставную жидкость, биопсийный материал, клещевой гомогенизат.
110. Результаты световой микроскопии субъективны и противоречивы, так как в процессе фиксации и окрашивания препарата боррелии теряют четкость морфологической структуры, что приводит к сложностям дифференциации боррелий с артефактами и непатогенными спирохетами.
111. В некоторых случаях для детекции боррелий используют иммуногистохимический метод диагностики или электронную микроскопию. Следует учитывать, что количество боррелий в большинстве клинических образцов очень небольшое, поэтому иногда применяют предварительное концентрирование боррелий с помощью центрифугирования. В любом случае отрицательный результат микроскопического исследования не исключает заболевания человека.
11. Приготовление и просмотр витальных препаратов
из клещей в темном поле микроскопа
112. Необходимое оборудование: микроскоп с темнопольным конденсором ОИ-13 и препаратоводителем типа СТ-12, осветитель ОИ-19 или другой системы, чистые обезжиренные предметные стекла толщиной не более 1,2 мм, покровные стекла 18x18 мм, заточенные препаровальные иглы. Оптимальна сухая система с общим увеличением x600 (объектив - x40; бинокулярная насадка АУ-12 - x1,5; окуляры - x10).
113. Для приготовления препарата из взрослого клеща на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора объемом 20 мкл, в которую помещают исследуемую особь. Придерживая клеща одной препаровальной иглой, второй надо сделать 5-6 надрезов идиосомы и слегка надавить на нее так, чтобы в физиологический раствор вытекло небольшое количество бурого по цвету материала. Этот материал, состоящий преимущественно из обрывков эпителия дивертикул средней кишки и элементов ее содержимого, круговым перемещением остатков исследуемого клеща равномерно распределяют по площади 0,7-0,8 кв. см. Затем каплю перекрывают покровным стеклом. Такой препарат начинает подсыхать через 10-15 мин., поэтому его просмотр следует начинать немедленно после приготовления. При необходимости некоторое время он может быть сохранен во влажной камере.
114. Для просмотра препарата освещение устанавливают так, чтобы при закрытой диафрагме осветителя на наложенном на зеркало микроскопа листе бумаги можно было четко видеть изображение нити спирали лампы, что достигается передвижением патрона с ней в кожухе осветителя. После установки света открывают диафрагму осветителя, на верхнюю линзу конденсора наносят капли дистиллированной воды и помещают препарат на предметный столик микроскопа. Далее, используя объектив с небольшим увеличением (x8-x9), поднимая и опуская конденсор, следует добиться появления в поле зрения светлого пятна, которое с помощью зеркала и регулировочных винтов конденсора выводят на середину поля. Установив объектив x40, переходят к просмотру. Поля зрения просматривают параллельными рядами так, чтобы вся площадь препарата могла быть обследована равномерно. Для этого делают соответствующие интервалы между полями зрения в одном ряду, а также между соседними рядами.