115. В препаратах из сильно инфицированных клещей боррелий обычно удается обнаружить в самом начале просмотра. Но так как среди зараженных переносчиков, как правило, преобладают слабо инфицированные особи, то выявление спирохет часто требует большего объема работы.
116. Норма просмотра, при которой препарат может считаться отрицательным, составляет не менее 200-250 полей зрения. Аналогичным образом можно вести и исследование нимф. При этом объем капли физиологического раствора, в которой иссекают клеща, должен быть значительно меньше (не более 5 мкл).
117.
12. Приготовление и просмотр окрашенных
фиксированных препаратов из клещей
118. Необходимое оборудование: микроскоп со светлопольным конденсором и препаратоводителем, осветитель ОИ-19 или другой системы, предметные стекла толщиной не более 1,4-1,5 мм, острые ножницы, глазной пинцет. Оптимальное увеличение - x600-x750 в системе с масляной иммерсией (объективы: x90-x100).
119. Для приготовления препарата из взрослого клеща, удерживая его пинцетом, отрезают задний край тела исследуемой особи. Срез промакивают фильтровальной бумагой. Держа клеща вертикально, проводят срезом по поверхности предметного стекла, делая мазки по 2,5-3,0 см. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют. Наиболее простой способ - фиксация в пламени спиртовки или газовой горелки. Для этого предметное стекло (мазками вверх) трижды проводят над пламенем так, чтобы его прямое воздействие не превышало 1-2 сек. После этого препарат можно длительное время хранить в сухом месте при комнатной температуре.
120. Окраску проводят общепринятым способом по Романовскому - Гимза (40-60 мин. в 5% водном растворе Гимза с последующим ополаскиванием и высушиванием). Затем препарат необходимо докрасить кристаллическим фиолетовым в течение 10-30 мин., после этого слегка ополоснуть под тонкой струйкой воды, быстро удалить оставшиеся капли спринцовкой (фильтровальную бумагу использовать для этого не рекомендуется) и высушить.
121. Состав краски: 80 мл 2% раствора оксалата аммония (калия или натрия); 20 мл метилового или этилового спирта; 2 г кристаллического фиолетового. Краситель растворяют в спирте и смешивают с раствором оксалата. Полученную краску можно хранить при комнатной температуре не менее года и использовать многократно. Так как выцветание препарата начинается достаточно быстро, его просмотр должен быть проведен не позже чем через 2-3 недели после приготовления. До этого препараты нужно хранить в темноте. В случае выцветания препарата, возможно его повторное окрашивание кристаллическим фиолетовым указанным выше способом.
122. При просмотре препарата поиск боррелий ведут на тонких (не более одного слоя клеток) участках мазка с таким расчетом, чтобы в каждом из двух мазков просмотреть не менее 100-150 полей зрения. Выполнение этого объема работы с высокой степенью вероятности гарантирует обнаружение боррелий в препарате из инфицированного клеща.
123. Для приготовления препарата из нимфы ее раздавливают любым тонким инструментом с зашлифованным концом и фрагментами клеща проводят по предметному стеклу. Обычно таким путем удается сделать лишь один мазок, который обрабатывают и исследуют, как описано выше.
124. Обнаружение антигенов боррелий . Тесты для выявления антигенов боррелий в различном клиническом материале пока не нашли широкого применения в диагностической практике и используются только в исследовательских целях. Исключение составляет коммерческий тест «Lyme Urine Antigen Test» (LUAT, США), который применяется для лабораторной диагностики боррелиозов в Северной Америке. Недостатком данного теста является его низкая стандартизованность.
125. Молекулярные методы диагностики. Достижения науки открыли возможность использования в медицине методов молекулярного тестирования: автоматическая экстракция нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция в режиме «реального времени», автоматизированная детекция ДНК-мишени.
126. Полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР) позволяет с высокой степенью специфичности и чувствительности осуществлять детекцию ДНК или РНК микроорганизмов. Трудности культивирования боррелий и низкая концентрация возбудителя в клиническом материале определяют потенциальные преимущества ПЦР в качестве метода экспресс-диагностики Лайм-боррелиозов.
127. Использование ПЦР для исследования цереброспинальной жидкости больных нейроборрелиозом показало, что этот метод превосходит по чувствительности культуральный, но уступает серологическому тестированию. Чувствительность ПЦР-диагностики составляет при раннем боррелиозе 25–30%, при хроническом нейроборрелиозе – 10%.
128. Главной проблемой ПЦР-диагностики клещевых боррелиозов является большое количество ложноотрицательных результатов. В отличие от инфицированных клещей, в которых количество боррелий может достигать 4 500, клинический материал (цереброспинальная или внутрисуставная жидкость, синовиальная ткань, кровь и моча) содержит ничтожно малое их количество, что недостаточно для индикации методом ПЦР.
129. Исследование возможности ПЦР-диагностики при боррелиозах сосредоточено на тех стадиях заболевания, где серологический метод диагностики недостаточно информативен, прежде всего, на раннем боррелиозе и нейроборрелиозе.
130. Серологические методы диагностики. Определение антител к B.burgdorferi в сыворотке крови, цереброспинальной и внутрисуставной жидкостях в настоящее время является основным методом диагностики клещевых боррелиозов, особенно у больных с диссеминированной или хронической стадиями инфекции. Для этой цели используются реакция непрямой иммунофлюоресценции, РСК, РПГА, ИФА или ELISA, иммунный блоттинг.
131. Специфические иммуноглобулины к антигенам боррелий обычно начинают определяться у пациентов на 3–6-й неделе после начала инфекции. Изучение развития иммунного ответа у нелеченных больных Лайм-боррелиозом показало, что иммуноглобулины класса M начинают обнаруживаться на 2–4-й неделе после начала инфекции. Образование специфических IgM у инфицированных лиц обычно предшествует появлению иммуноглобулинов класса G. Однако у некоторых больных синтез IgM может задерживаться или отсутствовать вообще. На ранней стадии боррелиозной инфекции оба класса специфических иммуноглобулинов синтезируются в основном против ограниченного числа антигенов.
132. При раннем боррелиозе с целью установления сероконверсии важно исследовать парные сыворотки, полученные от пациентов с интервалом в 20–30 дней. Специфические иммуноглобулины класса M детектируются у 70–90% пациентов с боррелиозом при I стадии, у 30–80% – при II стадии и у 5–48% – при III стадии.
133. Специфические IgG выявляются у больных с I стадией – в 50–70% случаев, II стадией – в 65–100%, III стадией – до 100%.
134. Наличие IgМ к антигенам боррелий в сыворотке крови больных ЛБ указывает на раннюю стадию инфекции. В некоторых случаях IgM могут выявляться в течение 1–2 лет. Оба класса специфических иммуноглобулинов (G и М) могут определяться более 10 лет. Долго они сохраняются и после антибиотикотерапии.
135. Серологический анализ не всегда подходит для контроля эффективности лечения из-за отсутствия доказательств элиминации боррелий.
Иммуноглобулины класса G вырабатываются против целого ряда боррелиозных антигенов, пик синтеза данного класса антител приходится на 6–8-ю неделю после начала инфекции. Их наличие, как правило, характеризует острую диссеминированную или хроническую органную манифестацию инфекции (II и III стадии).
136. Выявление IgG при раннем боррелиозе, при отсутствии IgM и клинической симптоматики заболевания, возможно, указывает на предшествующий контакт с боррелиями, который пациент не зафиксировал вследствие бессимптомного или абортивного течения инфекции. При наличии признаков поражения центральной нервной системы необходимо проводить анализ специфических антител в спинномозговой жидкости, так как отрицательный результат анализа сыворотки крови у больного нейроборрелиозом не свидетельствует об отсутствии у него инфекции.
137. Для позднего боррелиоза характерно значительное повышение титров IgG, особенно при атрофическом акродерматите (до 100% случаев). В литературе описаны немногочисленные примеры серонегативного Лайм-боррелиоза с клинически неясными симптомами, что, в основном, обусловлено иммуносупрессией разного генеза. В таких случаях для адекватной диагностики особо значимым является обнаружение у обследуемых лиц непосредственно возбудителя инфекции.
138. Методология серодиагностических исследований. Согласно рекомендаций Второй национальной конференции по серологической диагностике болезни Лайма (1994г.), для выявления активной инфекции используют двухшаговый принцип серологической диагностики, который значительно увеличивает эффективность исследования.
139. С этой целью на первом этапе серологического обследования рекомендуют использовать чувствительный иммуноферментный или иммунофлюоресцентный тест, на втором – последующее подтверждение результатов анализа с помощью метода иммунного блоттинга, который позволяет выявить ложноположительные результаты, полученные на первом этапе исследования, и тем самым повысить специфичность анализа.
140. Однако серодиагностика болезни Лайма существенно осложняется антигенной гетерогенностью представителей B.burgdorferi sensu lato, оказывающей негативное влияние на показатели чувствительности и специфичности используемых диагностических тест-систем.
141. Реакция непрямой иммунофлюоресценции. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) является первым методом, широко примененным для серодиагностики боррелиозов. Основной компонент, используемый для постановки РНИФ, инактивированные боррелии (корпускулярный антиген), фиксированные на предметном стекле. Инкубация сыворотки больного с корпускулярным антигеном приводит к связыванию специфических антиборрелиозных антител.