Для определения изоэлектрической точки желатина в 6 сухих пробирок последовательно наливают реактивы в количествах
(в мл), указанных в таблице:
| № про-бир-ки | Н2О | 0,1 М раствор СН3СООН | 1М раствор СН3СООН | 0,1М раствор СН3СООNa | 1% раствор желати-на | рН среды |
| 1 | 3,8 | 0,8 | - | 2,0 | 2,0 | 5,6 |
| 2 | 3,5 | 0,5 | - | 2,0 | 2,0 | 5,3 |
| 3 | 3,0 | 1,0 | - | 2,0 | 2,0 | 5,0 |
| 4 | 2,0 | 2,0 | - | 2,0 | 2,0 | 4,7 |
| 5 | - | 4,0 | - | 2,0 | 2,0 | 4,4 |
| 6 | 3,2 | - | 0,8 | 2,0 | 2,0 | 4,1 |
Содержимое каждой пробирки перемешивают и затем во все пробирки медленно по стенке добавляют по 2 мл 96% этанола (или ацетона). Через 30 минут определяют изоэлектрическую точку желатина. Она будет соответствовать рН пробирки с максимальной степенью помутнения.
Отметить степень помутнения в пробирках и записать изоэлектрические точки казеина и желатина.
РАБОТА 9. ДИАЛИЗ БЕЛКОВ
Диализом называется процесс разделения высоко- и низко- молекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (целлофан, коллодий, пергамент и др.). Молекулы белка, обладающие большими размерами и молекулярной массой, не способны проникать через такие мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества легко проходят через них. Диализ является очень удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например, от избытка солей. Простейшим диализатором может служить целлофановый или коллоидный мешочек, опущенный в стакан с водой.
Ход работы.
1. В пробирку наливают 2 мл 3% раствора яичного альбумина и добавляют 1 каплю насыщенного раствора сульфата аммония. Из листа целлофана, предварительно намоченного дистиллированной водой, делают мешочек и выливают в него содержимое пробирки. Края мешочка прикрепляют к середине стеклянной палочки (или зажимают между двумя стеклянными палочками, соединенными друг с другом резиновыми колечками). Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы стеклянная палочка легла на края стакана. Уровень жидкости в мешочке должен быть ниже уровня жидкости в стакане.
2. Через 1 час после начала диализа жидкость, находящуюся в стакане, проверяют на присутствие белка и сульфат-анионов:
а) Проба на белок.
С 1 мл жидкости из стакана проделывают биуретовую реакцию.
б) Проба на сульфат-анионы.
К 1 мл жидкости из стакана добавляют 3-4 капли 5% раствора хлорида бария и наблюдают образование осадка сульфата бария в виде белой мути.
3. Целлофановый мешочек вынимают из стакана. Жидкость из мешочка переливают в пробирку и проделывают биуретовую реакцию.
1. Записать результаты реакции и сделать выводы.
2. Зарисовать диализатор.
РАБОТА 10. УСТРОЙСТВО КОЛОРИМЕТРА ФОТОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО КОНЦЕНТРАЦИОННОГО. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ
Колориметрический метод исследования широко применяется в лабораторной практике для количественного определения веществ в биологических объектах. В основе колориметрического метода лежит закон Ламберта – Меера - Бера (1852), согласно которому существует прямая пропорциональная зависимость между концентрацией вещества в окрашенном растворе и степенью поглощения лучей света данным раствором. Интенсивность поглощения света зависит не только от количества и природы растворенного вещества, но и от толщины слоя раствора, длины волны падающего света, температуры раствора.
Степень поглощения света окрашенным раствором выражается оптической плотностью (экстинцией), под которой понимают отношение интенсивности света, падающего на раствор, к интенсивности света, прошедшего через раствор. Величина оптической плотности обозначается буквой Е или D. Чем больше оптическая плотность, тем меньше света пропускает раствор, то есть между оптической плотностью и светопропусканием существует обратная пропорциональная зависимость (Е=lg 1/r, где r - коэффициент светопропускания). Для определения плотности или светопропускания используют фотоэлектрические концентрационные колориметры.
концентрационного ( КФК-2 )
Фотоэлектроколориметр предназначен для определения концентрации вещества в окрашенных растворах по их оптической плотности или коэффициенту светопропускания.
В качестве источника света в КФК-2 используется лампа накаливания (1). Световой поток от лампы накаливания проходит через диафрагму (2), объектив (3), усиливающий свет в 10 раз, и светофильтр (4).
В КФК-2 имеется набор светофильтров. Использование конкретного цветового светофильтра позволяет пропускать через раствор лучи определенной длины волны, поглощение которых характерно для исследуемого вещества. Обычно эффективная длина волны и цвет светофильтра указывают в используемом методе. Приведенная ниже таблица позволяет ориентировочно выбрать светофильтр для измерения оптической плотности некоторых окрашенных растворов:
| Окраска исследуемого раствора | Цвет необходимого светофильтра | Длина волны пропускаемого света в нм |
| Желтая | Синий | 420-450 |
| Оранжевая | Синий | 430-460 |
| Красная | Зеленый | 460-500 |
| Пурпурная | Зеленый | 490-530 |
| Синяя | Оранжевый | 590 |
| Сине-зеленая | Красный | 600-650 |
Световой поток, пройдя через светофильтр и кювету с раствором (5), падает на приемник света (6, 7) - фотоэлемент Ф-26 (в области спектра 315-540 нм) или фотодиод (в области спектра 590-980 нм). В фотоприемниках световая энергия преобразуется в электрическую, изменение количества которой отражает микроамперметр (9). Показания микроамперметра пропорцио- нальны силе светового потока, прошедшего через исследуемый раствор.
К фотоэлектроколориметру КФК-2 прилагается набор кювет, отличающихся расстоянием между рабочими гранями, через которые проходит световой поток. Это расстояние (в мм) указывается на одной из рабочих граней. В наборе по три кюветы с
рабочей длиной 5, 10, 20, 30 и 50 мм. На боковой стенке кюветы
имеется риска, до которой наливают раствор. При работе с летучими растворителями кюветы закрывают специальными крышками.
1. Микроамперметр (измерительный прибор имеет две шкалы: нижняя (D) - шкала оптической плотности (от 0 до 1,5), верхняя - регистрирует коэффициент светопропускания (от 0 до 100%).
2. Крышка кюветного отделения, которую при открывании и закрывании держат за специальные ручки (2а).
3. Рукоятка установки нужного светофильтра.
4. Рукоятка перемещения кювет, установленных в кювето- держатель в кюветном отделении.
5. Рукоятка включения фотоприемников (чувствительность). Возможны три положения этой рукоятки: 1, 2, 3 (чувствительность от меньшей к большей). Рукоятка устанавливается на цифры черного цвета в интервалах длин волн 315-540 нм или красного цвета при длине волн 590-980 нм.
6. Рукоятка “Установка грубо”.
7. Рукоятка “Установка точно”.
8. Включатель и выключатель сетевого напряжения находится на задней стенке прибора (внизу, слева).
9. Индикаторная лампочка.
Измерение оптической плотности на КФК-2
1. С помощью рукоятки 3 установить нужный светофильтр (по длине волны).
2. Рукояткой 5 установить чувствительность в положение 1 черного или красного цвета в зависимости от длины волны.
3. Рукоятки 6 и 7 (“установки грубо, точно”) повернуть до упора влево. При таком положении рукояток чувствительность минимальна, что предохраняет микроамперметр от перегрузки.