г) Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу.
К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 30% раствора гидроксида натрия и 1-3 капли 7% раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидроксида меди (II); перемешивают. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) или красный осадок оксида меди (I).
д) Качественная реакция на рибозу и дезоксирибозу с дифениламином.
Дифениламин дает синее окрашивание с дезоксирибозой и зеленое - с рибозой. К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель 1% раствора дифениламина и пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. Развивается сине-зеленое окрашивание.
е) Качественная реакция на углеводы с a-нафтолом.
К 5 каплям гидролизата добавляют 3 капли 0,2% спиртового раствора a-нафтола и 20 капель концентрированной серной кислоты. Появляется розово-фиолетовое окрашивание.
ж) Молибденовая проба на фосфорную кислоту.
К 10 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива и кипятят. При этом жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. Пробирку сразу охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.
Оформление работы
1. Зарисовать прибор для гидролиза.
2. Результаты работы записать в виде таблицы:
| Название реакции | Употребляемые реактивы | Развивающаяся окраска | Чем обусловлена реакция |
Техника безопасности
1. В работе используются реактивы, требующие осторожного обращения: 10% серная кислота, 10% и 30% гидроксид натрия, концентрированная серная кислота и гидроксид аммония, молибденовый реактив (содержит концентрированную азотную кислоту).
2. Соблюдайте правила пожарной безопасности, пользуясь песочной и водяной баней.
РАБОТА 14. ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОПРОТЕИДА ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ
Дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП) выделяют из тканей, богатых клеточными ядрами (селезенки, зобной железы и др.). ДНП нерастворимы в воде, но хорошо растворяются в щелочных и солевых растворах, поэтому при нейтрализации щелочных растворов или при разведении водой солевых растворов они выпадают в осадок.
Ход работы.
1. 0,5 г селезенки (или зобной железы) растирают в фарфоровой ступке со 100 мг стеклянного порошка, постепенно добавляя небольшими порциями 15 мл 5% раствора хлорида натрия. Затем содержимое ступки фильтруют через двойной слой марли.
В химический стакан вместимостью 150 мл наливают
60-90 мл дистиллированной воды и медленно, при непрерывном помешивании стеклянной палочкой вливают в воду полученный фильтрат. Нерастворимые в воде ДНП выпадают в осадок в виде нитей, наматывающихся на палочку. Выделенные ДНП осторожно вынимают вместе с палочкой, переносят в чистую пробирку и растворяют в 1-2 мл 0,4% раствора гидроксида натрия.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если нити ДНП не образовались, а выделился хлопьевидный осадок, то ему дают отстояться, после чего большую часть жидкости из стакана осторожно сливают, оставшуюся часть центрифугируют.
2. С полученным раствором ДНП делают качественные реакции на белок и ДНП:
а) Биуретовая реакция на белок.
К 10 каплям ДНП добавляют 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди. Раствор окрашивается в сине-фиолетовый цвет.
б) Реакция с дифениламином на дезоксирибозу.
К 10 каплям раствора ДНП добавляют 20 капель дифениламинового реактива (дифениламин, растворенный в ледяной уксусной кислоте с добавлением концентрированной серной кислоты), перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на 5-10 минут. Жидкость постепенно приобретает синее окрашивание, обусловленное реакцией дифениламина с дезоксирибозой.
Записать принцип использованного метода выделения ДНП и результаты качественных реакций.
Будьте внимательны при работе с 10% щелочью натрия и дифениламиновым реактивом.
РАБОТА 15. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РИБОЗЫ
ПО МЕТОДУ МЕЙБАУМА
Рибоза входит в состав РНК, нуклеотидов и некоторых коферментов. Существуют колориметрические методы определения содержания указанных веществ, основанные на количественном определении рибозы.
Метод Мейбаума основан на способности рибозы к дегидратации с образованием фурфурола, дающего с орцином соединение, окрашенное в сине-зеленый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию рибозы.
Ход работы
1. Построение калибровочной кривой
В пять сухих пробирок вносят основной стандартный раствор рибозы (содержит 12,5 мкг рибозы в 1 мл) и дистиллированную воду в количествах, указанных в таблице:
| № проб | Стандартный раствор (мл) | Н2О (мл) | Количество рибозы в пробе (мкг) |
| 1 | 0,2 | 0,8 | 2,5 |
| 2 | 0,4 | 0,6 | 5,0 |
| 3 | 0,6 | 0,4 | 7,5 |
| 4 | 0,8 | 0,2 | 10,0 |
| 5 | 1,0 | - | 12,5 |
В контрольную пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют автоматической пипеткой по
1 мл орцинового реактива, перемешивают и помещают в кипящую
водяную баню на 20 минут. Затем пробирки охлаждают под струей холодной воды, добавляют по 3 мл дистиллированной воды и содержимое перемешивают. Рабочие стандартные растворы
колориметрируют на КФК-2 против контроля в кюветах на 10 мл с красным светофильтром (длина волны 670 нм). Результаты определения оптической плотности используют для построения калибровочной кривой.
2. Определение количества рибозы в исследуемом растворе
К 1 мл исследуемого раствора рибозы добавляют 1 мл орцинового реактива и далее анализ проводят так же, как при построении калибровочной кривой.
Концентрацию рибозы находят по калибровочной кривой.
1. Результаты измерения оптической плотности стандартных растворов записать в таблицу:
| № проб | Содержание рибозы в пробе (мкг) | Е1 | Е2 | Е3 | Е ср. |
Е1, Е2, Е3 - значения оптической плотности одного стандартного раствора, полученные разными студентами.
2. Построить калибровочную кривую.
3. Записать, какое количество рибозы оказалось в исследуемом растворе ( в мкг/мл).
1. Категорически запрещается отмеривать орциновый реактив (готовится на концентрированной соляной кислоте) обычными пипетками.
2. Соблюдайте правила работы на КФК.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии /Под ред. Т. Т. Березова. М: Медицина, 1976. 294 с.
2. Кушманова О. Л., Ивченко Г. М. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. М: Медицина, 1983. 272 с.
3. Методические указания к лабораторным занятиям по биохимии /Под ред. В. В. Рудакова. Л., 1986. 54 с.
4. Кучеренко Н. Е., Бабенюк Ю. Д., Васильев А. Н. Биохимия: Практикум. Киев: Выща школа, 1988. 128 с.
5. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим занятиям по биохимии. М: Высшая школа, 1988.
239 с.