Петрозаводский государственный университет
БИОХИМИЯ БЕЛКОВ
Методические указания к лабораторным занятиям
по биологической химии для студентов II курса
медицинского факультета
Петрозаводск 1999
Рассмотрены и рекомендованы к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и техники “биология”
25 мая 1999 г.
Напечатаны по решению редакционно-издательского совета университета
Составители:
М. Н. Яковлева, кандидат биологических наук,
В. В. Осташкова, кандидат биологических наук.
Предисловие
Настоящие методические указания содержат лабораторные работы по разделу “Биохимия белков”, выполняемые студентами
II курса медицинского факультета в процессе изучения биологической химии. На лабораторных занятиях студенты овладевают современными методами экспериментальных исследований, закрепляют теоретические знания, полученные на лекциях, анализируют результаты. В каждой лабораторной работе излагаются принцип метода, ход эксперимента, советы по оформлению результатов и правила по технике безопасности.
РАБОТА 1. Цветные реакции на белки
Цветные реакции на белки являются качественными реакциями, обусловленными специфическими группами - радикалами. Некоторые из таких реакций широко используются в биохимической практике для изучения структуры и аминокислотного состава белков, их количественного определения.
1. Биуретовая реакция
(на обнаружение пептидных связей в белках)
Белки (пептиды) в щелочном растворе в присутствии солей меди (II) образуют комплексные ее соединения, окрашенные в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет.
Для пептидной (амидной) группы характерна лактам-лактимная таутомерия:
В щелочной среде преобладающая лактимная (енольная) форма полипептида взаимодействует с медью с образованием стабильного окрашенного комплекса:
Ход работы. К 1 мл 1% раствора белка (желатина, яичного белка или сывороточного альбумина) добавляют 1 мл 10% раствора щелочи (NaOH или KOH) и 1 каплю 1% раствора сульфата меди. Появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание.
2. НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
(на аминогруппу, находящуюся в a-положении)
Белки, полипептиды и свободные a-аминокислоты при нагревании реагируют с нингидрином (трикетогидринденгид-ратом) с образованием продукта конденсации, окрашенного в фиолетовый цвет:
Ход работы. К 1 мл 1% раствора белка прибавляют 0,5 мл 0,5% раствора нингидрина и нагревают до кипения. Появляется фиолетово-синее окрашивание.
Проделывают эту реакцию с раствором аминокислоты, взяв вместо раствора белка 1% раствор глицина. Сравнить полученные результаты и сделать вывод.
3. Реакция Сакагучи (на аргинин)
Белки, содержащие аргинин, в присутствии щелочи дают красное окрашивание с гипобромитом и a-нафтолом. Гуанидиновая группа аргинина окисляется гипобромитом, и окисленный аргинин при взаимодействии с a-нафтолом образует продукт конденсации красного цвета:
Ход работы. К 0,5 мл 1% раствора белка (яичного белка, желатина) добавляют 0,5 мл 10% раствора щелочи, 3 капли 0,1% спиртового раствора a-нафтола и после перемешивания 2-3 капли 2% раствора гипобромита натрия. Появляется красное окрашивание.
4. Реакция Фоля (на цистеин и цистин)
При кипячении белка со щелочью от цистеина (цистина) легко отщепляется сера в виде сероводорода, который в щелочной среде образует сульфид натрия:
СH2SH CH2OH
│ │
CHNH2 + 2 NaOH ¾® CHNH2 + Na2S + H2O
│ │
COOH COOH
цистеин серин
Для выявления сульфида натрия используют ацетат свинца, который при взаимодействии с гидроксидом натрия превращается в его плюмбит:
Pb(CH3COO)2 + 2NaOH ® Pb(ONa)2 + 2CH3COOH
В результате взаимодействия ионов серы и свинца образуется сульфид свинца черного или бурого цвета:
Na2S + Pb(ONa)2 + 2H2O ® PbS¯ + 4NaOH
(черный
осадок)
Ход работы. К 1 мл 1% раствора яичного белка или кусочку шерстяной нити добавляют 1 мл 30% щелочи и 3-4 капли 5% раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость окрашивается в бурый или черный цвет.
Реакцию Фоля проделывают с 1% раствором желатина, в составе которого нет серосодержащих аминокислот. Черный осадок сульфида свинца не образуется.
5. Ксантопротеиновая реакция
(на ароматические аминокислоты)
При нагревании с концентрированной азотной кислотой белки дают желтое окрашивание. Реакция обусловлена наличием в белках циклических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот, имеющих желтую окраску:
Нитропроизводные аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет:
Ход работы. К 1 мл 1% раствора альбумина или яичного белка прибавляют 5 капель концентрированной азотной кислоты. Появляется осадок. При осторожном нагревании смесь окрашивается в желтый цвет. После охлаждения осторожно добавляют 10 капель концентрированного раствора аммиака (или 30% раствора едкого натра), при этом желтая окраска переходит в оранжевую.
Проделать ксантопротеиновую реакцию с ароматической аминокислотой, взяв вместо раствора белка 0,1% раствор тирозина.
Ксантопротеиновая реакция не идет с белками, не содержащими циклических аминокислот (клупеином, сальмином, желатином). Проделать реакцию с 1% раствором желатина.
6. Реакция Милона (на тирозин)
Реакция Милона открывает в белке тирозин, в составе которого имеется фенольный радикал. При нагревании белка с реактивом Милона (смесь нитратов и нитритов ртути (I) и (П), растворенных в концентрированной азотной кислоте) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в красный цвет. Реактив Милона дает окрашивание почти со всеми фенолами:
Ход работы. К 1 мл 1% раствора яичного белка добавляют 3-5 капель реактива Милона и осторожно нагревают до образования окрашенного в красный цвет осадка.
Проделать реакцию Милона с 1% раствором желатина, 0,1% раствором тирозина и фенола.
7. Реакция Адамкевича (на триптофан)
Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами (глиоксиловой кислотой) с образованием окрашенных продуктов конденсации:
Глиоксиловая кислота всегда присутствует в небольшом количестве в ледяной уксусной кислоте, которую используют в реакции Адамкевича.
Ход работы. К 1 мл 1% раствора яичного белка добавляют 1 мл ледяной (концентрированной) уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения осадка. После охлаждения к смеси осторожно добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты (по каплям по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешались). Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.
Проделывают реакцию Адамкевича с 0,1% раствором триптофана.
8. Реакция Ваузене (на триптофан)
Белки, содержащие триптофан, дают в кислой среде в присутствии нитрита натрия и формальдегида сине-фиолетовое окрашивание. В этой реакции триптофан взаимодействует с формальдегидом с образованием продукта конденсации (бис-2-триптофанилметана), который окисляется нитритом натрия до бис-2-триптофанилкарбинола. Последний в присутствии минеральных кислот образует соли сине-фиолетового цвета.
Ход работы. К 2 мл 1% раствора яичного белка добавляют 1 каплю 2,5% раствора формальдегида. К полученной смеси, тщательно перемешивая, добавляют осторожно по каплям 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом. Через 10 минут добавляют, перемешивая, 10 капель 0,5% раствора нитрита натрия. Появляется сине-фиолетовая окраска.
9. Реакция Паули (на гистидин и тирозин)
Реакция Паули позволяет обнаружить в белке аминокислоты гистидин и тирозин, которые образуют с диазобензол-сульфоновой кислотой комплексные соединения вишнево-красного цвета. Диазобензол-сульфоновая кислота образуется в реакции диазотирования при взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия (или калия) в кислой среде:
Ход работы. К 1 мл 1% раствора сульфаниловой кислоты (готовится на 5% растворе соляной кислоты) прибавляют 2 мл 0,5% раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл 1% раствора яичного белка и после перемешивания 6 мл 10% раствора карбоната натрия. После перемешивания смесь окрашивается в вишнево-красный цвет.
Проделывают эту реакцию с 0,1% раствором гистидина, сравнивают полученные результаты и делают вывод.
Оформление работы
Результаты работы оформить в виде таблицы:
| Название реакции | Материал исследования | Употреб-ляемые реактивы | Окраска продукта | Чем обус- ловлена реакция |
Техника безопасности
1. Категорически запрещается отмеривать концентрированные кислоты и щелочи обыкновенными пипетками. Для отмеривания реактивов использовать мерные пробирки.
2. Будьте внимательны при наливании концентрированных кислот и щелочей!
3. В процессе нагревания постоянно перемешивайте жидкость, не допускайте выброса ее из пробирки.
4. Соблюдайте правила пожарной безопасности.
РАБОТА 2. Выделение белков из мышечной ткани
Миофибриллы мышечной клетки содержат сократительные белки (миозин и актин) и регуляторные белки (тропомиозин и тропонин). Белки миофибрилл не растворяются в воде, но их можно экстрагировать из мышечной ткани солевыми растворами с концентрацией соли 0,5 моль/л. Многие белки саркоплазмы (гиалоплазмы мышечных клеток) растворимы в воде или в солевых растворах низкой концентрации (0,05 моль/л). При экстракции мышечной ткани 5% раствором хлорида калия извлекаются как миофибриллярные, так и саркоплазматические белки.