Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск (стр. 11 из 13)
6.1 Лабораторная работа «Реакция окисления тиамина
в тиохром»
Принцип реакции. Витамин В1 в щелочной среде под действием гексоциано-III феррата калия окисляется в тиохром - пигмент желтого цвета, который в изобутиловом спирте дает интенсивно синюю флюоресценцию:
Материалы и реактивы: тиамин в концентрации 5 мкг в 1 мл;
1 %-ный раствор K3Fe(CN)6; 30 %-ный раствор NaOH; изобутиловый спирт.
Оборудование: источник ультрафиолетового излучения (флюороскоп), штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы. К 1 мл раствора витамина В1 прибавляют 2 мл смеси (1 мл раствора K3Fe(CN)6 и 1 мл раствора NaOH), тщательно перемешивают и оставляют на три минуты. Затем прибавляют 5 мл изобутилового спирта, энергично и равномерно встряхивают в течение 2 мин. Изобутиловый экстракт тиохрома в ультрафиолетовых лучах имеет интенсивную синюю флюоресценцию. Это очень чувствительная специфическая реакция.
6.2 Лабораторная работа «Реакция восстановления
рибофлавина (витамина В2)»
Образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной соляной кислоте водород восстанавливает желтый рибофлавин сначала в родофлавин (промежуточное соединение) красного цвета, а затем в бесцветный лейкофлавин:
Материалы и реактивы: концентрированная HCl; металлический цинк; 0,025 %-ный раствор витамина B2 (эмульсия рибофлавина в воде).
Оборудование: пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирку приливают 1 мл раствора витамина В2, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Выделяющийся водород реагирует с рибофлавином, восстанавливая его, и жидкость постепенно окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин.
6.3 Лабораторная работа «Реакция на пиридоксин
(витамин В6) с хлоридом железа (III)»
При взаимодействии пиридоксина с раствором хлорида железа жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования комплексной соли типа фенолята железа.
Материалы и реактивы: водный 1 %-ный раствор витамина В6; 1 %-ный раствор FeCl3.
Оборудование: пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирке смешивают 1 мл водного раствора пиридоксина и 2 капли раствора хлорида железа. Смесь встряхивают. Наблюдают окрашивание жидкости в красный цвет.
6.4 Лабораторная работа «Выделение фолиевой кислоты
из дрожжей и ее обнаружение»
Фолиевая кислота хорошо растворима в 0,1 моль/л растворе NaOH. При экстрагировании фолиевой кислоты из дрожжей и ультрафиолетовом облучении наблюдается ее интенсивная голубая флюоресценция.
Материалы и реактивы: дрожжи пищевые; ледяная уксусная кислота; 0,4 %-ный раствор перманганата калия; 3 %-ный раствор пероксида водорода; 0,1 моль/л и 0,005 моль/л растворы гидроксида натрия; индикаторная бумага; кварцевый песок.
Оборудование: центрифуга, флюороскоп, центрифужные пробирки, ступка с пестиком, пипетки.
Ход работы. В ступку помещают 10 г дрожжей, прибавляют
10 мл 0,1 моль/л раствора NaOH, 2 г кварцевого песка и растирают в течение 5 мин. Затем центрифугируют в течение 15 мин при скорости 800 об/мин.
К 10 каплям надосадочной жидкости приливают 20 капель ледяной уксусной кислоты (pH=3,0) и 10 капель раствора KMnO4 так, чтобы розовая окраска не исчезала в течение 10 мин (при её исчезновении следует прилить ещё несколько капель KMnO4). Через 10 мин избыток перманганата калия удаляют путем добавления 4-5 капель раствора H2O2 и приливают 0,005 моль/л раствора NaOH (около 5 мл) до pH
4,0-4,5 (в присутствии индикатора).
При ультрафиолетовом облучении фолиевой кислоты в щелочном растворе в флюороскопе наблюдается интенсивная голубая флюоресценция.
6.5 Реакции на аскорбиновую кислоту (витамин С)
6.5.1 Лабораторная работа «Качественные реакции на витамин С»
Аскорбиновая кислота способна легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндо-фенол, гексоциано-(III)-феррат калия, нитрат серебра, метиленовый синий. При этом окисленные формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (синий цвет) и метиленового синего восстанавливаются в бесцветные лейкосоединения, а K3Fe(CN)6 восстанавливается до K4Fe(CN)6, который с ионами валентного железа дает соль Fe[Fe(CN)6]3 синего или зеленого цвета. Реакция восстановления метиленового синего происходит по уравнению:
Материалы и реактивы: 0,1 %-ный раствор 2,6-дихлорфенол-индофенола; 10 %-ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,01 %-ный раствор метиленового синего; 10 %-ный раствор Na2CO3; 1 %-ный раствор K3Fe(CN)6; 1 %-ный раствор FeCl3.
Оборудование: штатив с пробирками, капельницы, пипетки, термостат.
Ход работы. Для проведения реакции с 2,6-дихлорфенолиндофе-нолом в пробирку вносят 0,5 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, 1-2 капли раствора HCl и каплями раствор аскорбиновой кислоты. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола обесцвечивается.
Для проведения реакции с метиленовым синим в две пробирки вносят по одной капле раствора метиленовой сини и по одной капле раствора бикарбоната натрия. В первую вливают пять капель раствора аскорбиновой кислоты, во вторую – пять капель воды и ставят обе пробирки в термостат при температуре от 37 до 40 °С. Через некоторое время в пробирке с раствором аскорбиновой кислоты жидкость обесцвечивается.
Для реакции с гексациано-(III)-ферратом калия к 1 мл раствора аскорбиновой кислоты прибавляют 1 мл раствора K3Fe(CN)6 и 0,5 мл раствора FeCl3. Наблюдают образование сине-зеленого окрашивания.
6.5.2 Лабораторная работа «Количественное определение витамина С по Тильмансу»
Метод количественного определения аскорбиновой кислоты основан на ее способности окисляться 2,6-дихлорфенолиндофенолом до дегидроаскорбиновой кислоты. По количеству 2,6-дихлорфенол-индофенола, затраченного на титрование, определяют количество аскорбиновой кислоты в исследуемом материале. Как только все количество витамина С окислится, титруемый раствор приобретает розовую окраску за счет образования недиссоциированных молекул 2,6-дихлор-фенолиндофенола (в кислой среде). В щелочной среде 2,6-дихлор-фенолиндофенол имеет синюю окраску, в кислой – красную, а при восстановлении обесцвечивается:
Материалы и реактивы: соляная кислота (2 %-ный раствор); натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола 0,0005 моль/л раствор (молекулярная масса – 290, грамм-эквивалент – 145).
Оборудование: растительные продукты (капуста, хвоя, картофель, шиповник), фарфоровая ступка с пестиком, коническая колба, микробюретка, стаканы для титрования, пипетки, воронки, весы с разновесами, стеклянный песок.
Ход работы. Взвешивают 1 г растительного продукта, тщательно растирают в фарфоровой ступке со стеклянным песком. К растертой массе прибавляют 9 мл раствора соляной кислоты и отстаивают. Через 10 мин содержимое перемешивают и фильтруют. Для количественного определения берут 3 мл фильтрата, помещают в коническую колбу и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 секунд; 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты.
Массовую концентрацию аскорбиновой кислоты (мг) рассчитывают по формуле
,где Q – количество аскорбиновой кислоты (0,088 мг), соответствующее 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола;
А – количество 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндо-фенола, затраченного на титрование, мл;
V0– общее количество экстракта, мл;
V1 – объем экстракта, взятый для титрования, мл;
а – количество пищевого продукта, мг.
7 НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Нуклеиновые кислоты – это макромолекулы кислотного характера, содержащиеся в ядре, а так же в митохондриях, хлоропластах и цитоплазме, состоят из нуклеотидов.
В живых организмах присутствуют два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Их биологическая функция заключается в хранении и передаче наследственной информации живых организмов. Наследственная информация (наследственные признаки) определяет вид, форму, химический состав и функции живой клетки и всего организма в целом.
Мономеры нуклеиновых кислот – нуклеотиды, принимают участие во множестве биохимических процессов. Наиболее известна роль пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в качестве мономеров-предшественников при биосинтезе РНК и ДНК. Помимо этого пуриновые рибонуклеотиды выполняют функции универсальных источников энергии (например, АТФ), входят в состав коферментов (ФАД, НАД, НАДФ). Пиримидиновые нуклеотиды входят в состав макроэргов углеводного обмена (Приложения П-У).
7.1 Лабораторная работа «Обнаружение пуриновых
оснований в составе нуклеопротеидов»